《食品科學》：中國農業科學院張書文研究員、天津科技大學李紅娟副教授等：復合磷酸鹽修飾提升乳清蛋白熱穩定性與表面特性的機制

乳清蛋白作為乳中的重要蛋白，含有所有的必需氨基酸，是補充人體所需蛋白質的一種重要來源，具有豐富的營養價值和廣泛的應用前景。然而，天然乳清蛋白自身性質不穩定，在加工生產過程中高級結構易被破壞，致使其功能特性發生改變，限制了乳清蛋白的應用，使其難以滿足現代食品工業對復雜加工條件的需求。此外，在生物利用度、界面穩定性等方面的不足也制約了其在高端功能性產品中的應用潛力。因此，乳清蛋白改性技術的研究變得尤為重要。

近年來，通過物理、化學或生物手段改善乳清蛋白的功能特性已經成為研究熱點。其中，磷酸化修飾因其操作簡便、成本低及改性效率高等優勢備受關注。濕熱磷酸化修飾已被證實具有提高蛋白起泡性（FC）、溶解性、熱穩定性等特性的作用。加熱可以使蛋白結構展開，暴露出更多的磷酸化位點，磷酸基團的引入可通過靜電屏蔽、氫鍵重構和疏水相互作用調控蛋白質構象，進而優化其溶解性、乳化活性及熱穩定性。單一的磷酸鹽可能只對特定的氨基酸殘基（如絲氨酸、蘇氨酸或賴氨酸的ε-氨基）進行磷酸化修飾，而復合磷酸鹽的協同作用可覆蓋更多的反應位點。李婷婷利用三聚磷酸鈉、六偏磷酸鈉（SHMP）和焦磷酸鈉（SPP）的復合磷酸鹽改性蛋清蛋白，改性后的磷酸化蛋白乳化性和泡沫穩定性（FS）有略微提升、持水性和持油性有很大程度的提高。顧繼鵬等同樣用復合磷酸鹽改善了羊奶基復配乳液的穩定性。劉戰洪等將復合磷酸鹽應用于乳制品中，發現質量濃度0.15～0.2?g/100?mL的復合磷酸鹽可以提高牛乳粉的沖調性，防止蛋白變性，解決超高溫瞬時滅菌羊乳熱不穩定問題。

現有的研究多聚焦于單一磷酸鹽對乳清蛋白的作用機制，對復合磷酸鹽協同效應的系統解析仍不夠全面，缺乏從“多濃度/多配比”實驗設計出發，到“結構-性質-功能”多層次關聯分析，最終闡明協同作用分子機理并確定最優復配方案的完整研究體系。中國農業科學院農產品加工研究所的董暄、張書文*，天津科技大學食品科學與工程學院的李紅娟*等將SPP與SHMP復配，對乳清蛋白進行濕熱磷酸化修飾，系統探究復合磷酸鹽的配比及濃度對乳清蛋白乳化性、FC、溶解性、持水性、熱穩定性、動力學穩定性等功能特性以及對乳清蛋白二級結構、微觀結構的影響，闡釋其協同改善乳清蛋白功能特性的分子機制。通過對比復合磷酸鹽的改性效果，得到最優的復配條件，為乳清蛋白在高附加值食品工業中的應用提供理論支撐。

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復合磷酸鹽對乳清蛋白微觀結構的影響

圖1為WPI90和磷酸化乳清蛋白的微觀結構圖像。WPI90具有平整光滑的表面結構，并且顆粒體積相對較大，這與Agarwal等的研究結果一致。乳清蛋白的球狀結構歸因于特定氨基酸序列。在折疊過程中，疏水相互作用將疏水殘基埋入內部，親水殘基暴露于表面。氫鍵穩定了內部的二級結構。相比之下，經不同濃度的復合磷酸鹽修飾后蛋白表面較粗糙，形成較為密集的小顆粒，并且表面帶有凹孔，這些結構特征在SHMP與SPP質量比為1∶2和2∶1的條件下比在1∶1條件下更突出。這可能是由于磷酸化對乳清蛋白表面疏水性和電荷的影響，并且濕熱處理破壞了乳清蛋白的結構。在先前關于磷酸鹽改性牛乳濃縮蛋白的研究中已經描述了類似的微觀結構。磷酸化會引入負電荷并降低修飾蛋白的疏水性，從而使修飾前后的蛋白具有不同微觀結構。

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復合磷酸鹽對乳清蛋白二級結構的影響

圖2顯示了添加復合磷酸鹽后的磷酸化乳清蛋白以及對照樣品的FTIR。其中3?500～3?200?cm－1的寬帶為—NH拉伸振動，歸因于蛋白質分子內和分子間氫鍵的彎曲振動。酰胺I帶、酰胺II帶、酰胺III帶分別對應1?600～1?700、1?500～1?580、1?200～1?400?cm－1波數范圍。酰胺I帶由α-螺旋（1?650～1?658?cm－1）和β-折疊（1?638～1?687?cm－1）產生。酰胺II帶吸收峰歸因于N—H 彎曲振動與C—N拉伸振動。酰胺III帶則用于表征α-螺旋（1?290～1?340?cm－1）、β-折疊（1?181～1?248?cm－1）以及無規卷曲（1?255～1?288?cm－1）的復合振動。1?122、1?136、1?158?cm－1附近的條帶與酯鍵O＝C—O中C—O的伸縮振動有關。添加磷酸鹽后，磷酸化樣品在970～980?cm－1和890～900?cm－1范圍出現吸收峰，分別對應P—O和P＝O拉伸振動，表明乳清蛋白中被成功引入磷酸基團。此外，二級結構中的α-螺旋含量有所增加，由于α-螺旋位于蛋白的疏水核心區域，這說明磷酸化通過重構疏水相互作用增強了蛋白的熱穩定性。蛋白質二級結構的變化由加熱和磷酸化修飾共同引起，其中磷酸化修飾會破壞蛋白質-蛋白質相互作用并改變蛋白質分子的內部結構。

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復合磷酸鹽對乳清蛋白熱穩定性的宏觀影響

將磷酸鹽修飾后的乳清蛋白配制成質量濃度10?g/100?mL的蛋白溶液，對其進行熱處理并觀測加熱后的宏觀狀態。由圖3可知，磷酸化乳清蛋白溶液經100?℃、30?min熱處理后溶液呈現輕微渾濁狀體，而WPI90在75?℃以上加熱會導致蛋白變性，因此在加熱后蛋白發生變性聚集，溶液渾濁，說明磷酸化修飾引入負電荷在一定程度上可以提高乳清蛋白的熱變性溫度，相較WPI90添加復合磷酸鹽的乳清蛋白濁度降低了約80%。CK組和磷酸化乳清蛋白溶液經高壓滅菌鍋121?℃、15?min熱處理后溶液均形成了半透明或不透明的凝膠塊，僅有添加質量濃度0.06?g/100?mL、SHMP與SPP質量比為2∶1的磷酸化蛋白經加熱后仍保持流動性。這是由于乳清蛋白在劇烈的濕熱條件下發生了不可逆的變性，通過強烈的疏水相互作用和大量二硫鍵形成了三維網絡結構，而磷酸化修飾帶來的電荷效應在高壓滅菌的極端條件下，其抑制作用無法阻止凝膠的形成。

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復合磷酸鹽對乳清蛋白熱處理后濁度的影響

蛋白質以懸浮的形式分散于溶液中，濁度是反映蛋白聚集程度的重要指標。影響溶液濁度的因素主要包括顆粒（膠束）的數量、相對大小或折射率等。由圖4可知，WPI90在未加熱處理時具有較低的濁度，經100?℃處理后，WPI90和添加復合磷酸鹽制備得到的磷酸化乳清蛋白濁度均有所增大，其中WPI90的濁度顯著增大至2.51（P＜0.05），這是因為乳清蛋白的變性溫度為70?℃，在高于70?℃條件下大量的乳清蛋白發生變性，相互聚集，形成較大的顆粒，導致溶液的濁度增大。而磷酸化乳清蛋白相較加熱后WPI90的濁度明顯較低（P＜0.05），這是由于磷酸鹽帶有強負電荷，可以增強蛋白分子間的靜電斥力，添加復合磷酸鹽后乳清蛋白的溶解性、靜電斥力和熱穩定性提升，有效抑制了蛋白質的聚集和沉淀，因此對濁度影響較小。

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復合磷酸鹽對乳清蛋白動力學穩定性的影響

圖5反映了不同樣品在室溫條件下24?h內質量濃度和顆粒直徑的整體變化，通過掃描樣品的底部、中部、頂部得到整體的穩定性變化規律。WPI90的動力學穩定性指數（TSI）值在熱處理后的前6?h顯著增加，隨后逐漸增高至最大值，處于不穩定的狀態。由圖6可知，WPI90樣品的底部出現了大面積正峰，說明樣品的底部質量濃度增加，這是由于天然乳清蛋白在加熱過程中會出現蛋白聚集、顆粒增大的現象，因此在放置過程中蛋白沉淀，使底部質量濃度增加，背向散射光信號增強。在0～24?h內添加質量濃度0.06?g/100?mL、SHMP與SPP質量比為1∶2的磷酸化乳清蛋白，加熱后整體TSI值較低，背向散射光圖中部并未出現明顯的正負峰，說明蛋白體系比較穩定。這可能是由于在該條件下增強了蛋白質表面的負電荷，提供了有效的空間位阻，在加熱過程中可以對抗蛋白質變性，維持了溶液體系的穩定性。SHMP與SPP質量比為2∶1的3?組磷酸化乳清蛋白背向散射光底部和頂部出現較強信號，中部曲線光滑，說明在頂部出現顆粒不穩定現象。其余5?組磷酸化乳清蛋白在24?h內TSI值緩慢升高，頂部和底部均出現小面積正峰，中部曲線雜亂，說明中部區域顆粒聚集到頂部或底部，剩余液相中顆粒少且小。適量的磷酸化條件可以提供有效的空間位阻，反之則會使空間位阻失效，促進聚集。

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復合磷酸鹽對乳清蛋白溶解性的影響

溶解性是乳清蛋白最重要的功能特性，因為它會影響乳清蛋白的乳化性、FC和膠凝性等特性。由圖7可知，添加不同濃度的復合磷酸鹽后乳清蛋白的溶解性普遍得到提升，僅有少數復合磷酸化蛋白溶解性未得到明顯改善，這可能是由于磷酸化蛋白質分子具有更大的靜電排斥力，有助于它們在分散劑中更快地溶解，但在制備過程中濕熱處理可能會導致聚集體的產生，從而影響乳清蛋白的溶解性。其中在添加不同質量濃度且SHMP與SPP質量比為2∶1的復合磷酸鹽后，磷酸化蛋白的溶解性得到顯著提升（P＜0.05），這可能是由于適宜的磷酸化條件可以有效改善蛋白質分子和水分子之間的相互作用，從而形成水合層和可溶性聚集體，使磷酸化乳清蛋白的溶解性增大。

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復合磷酸鹽對乳清蛋白FC及FS的影響

有研究報道，磷酸鹽有助于蛋白質泡沫結構的形成；表面疏水性增加、兩親性平衡增強以及磷酸基團所帶負電荷增加靜電排斥力從而減少分子聚集，這些都是改善磷酸化乳清蛋白FC的原因。如圖8所示，WPI90的FC為（30.1±0.8）%，添加質量濃度0.06、0.09?g/100?mL且SHMP與SPP質量比為2∶1的復合磷酸鹽后，FC明顯提高至50%～60%（P＜0.05）。然而，在SHMP與SPP質量比為2∶1的條件下僅有質量濃度0.06?g/100?mL的磷酸化蛋白FC和FS均得到改善，質量濃度為0.09?g/100?mL的磷酸化蛋白FS沒有得到提升，說明磷酸化雖然使得乳清蛋白的FC增加，但形成的泡沫不夠穩定，未能很好地形成結實而有彈性的蛋白質膜。除此以外，其余樣品組的FS未有明顯提升，甚至呈降低趨勢，這可能由于大直徑聚集體的存在形成了穩定的結構，減少了具有黏結性的界面涂層，從而導致聚結速率降低，加速了泡沫的降解。

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復合磷酸鹽對乳清蛋白乳化性及乳化穩定性的影響

乳化性能夠反映乳液形成過程中蛋白質在油-水界面處快速吸附的能力。由圖9可知，添加質量濃度0.06?g/100?mL、SHMP與SPP質量比為1∶1的復合磷酸鹽后，乳清蛋白的EAI顯著升高（P＜0.05），但其余8?組磷酸化乳清蛋白EAI均未有變化或呈降低趨勢，這可能是由于在該條件下，乳清蛋白對油-水界面的吸附能力和降低界面張力的能力達到平衡，而其他條件則因離子強度干擾、界面競爭或蛋白聚集等因素抑制了初始乳化效率。除此以外，磷酸化乳清蛋白乳化活性的降低也歸因于磷酸化誘導的蛋白二級結構和三級結構的改變。在添加質量濃度0.06、0.09?g/100?mL，SHMP與SPP質量比為2∶1的復合磷酸鹽后，乳清蛋白的ESI均顯著升高了2～3?倍（P＜0.05），這可能是由于SHMP具有極強的多電荷特性，因此在SHMP與SPP質量比為2∶1的條件下顯著增加了蛋白體系中的負電荷，改變蛋白分子間的靜電相互作用，從而提升了乳清蛋白在油-水界面穩定吸附的能力。

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復合磷酸鹽對乳清蛋白持水性的影響

由圖10可知，添加質量濃度為0.03、0.06?g/100?mL的復合磷酸鹽后，大多數乳清蛋白的持水性普遍未得到改善，反而呈下降趨勢，而添加質量濃度0.06、0.09?g/100?mL、SHMP與SPP質量比為2∶1的復合磷酸鹽后乳清蛋白的持水性由20%分別提高至50%和90%。持水性的增加是由于濕熱磷酸化處理誘導形成了均勻的網絡狀結構，從而能夠有效束縛水相。值得注意的是，這種網絡狀結構易受到鹽離子濃度、加熱溫度、蛋白濃度的影響。有研究表明，磷酸化能夠提高乳清蛋白的持水力，磷酸化程度和熱聚合程度也會顯著影響乳清蛋白持水力。這是由于添加磷酸鹽會改變反應體系中的離子濃度，一定程度的熱處理會使乳清蛋白隱藏在分子內的巰基和疏水基團暴露出來，將蛋白質分子間以二硫鍵相連，從而影響持水性。因此，磷酸化乳清蛋白持水性的變化可能是受磷酸化和熱處理等多種因素共同作用影響。

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乳清蛋白含有人體所需的9?種必需氨基酸，具有較高的生物利用度，是補充人體所需蛋白質的一種重要來源。但由于乳清蛋白自身性質不穩定，其結構易被加工處理手段破壞，致使其功能特性發生改變，限制了乳清蛋白在食品中的應用。磷酸化已被證明是改善食物蛋白質功能特性的有效方法。SHMP是強螯合劑，能結合二價離子（Ca2+＞Mg2+＞Fe2+），阻斷離子介導的蛋白交聯，SPP呈堿性，能使蛋白遠離等電點，增加蛋白質表面的凈負電荷，增強靜電斥力，將二者復配理論上可以使其功能互補，降低單種磷酸鹽用量，避免堿味或澀感，從而在多功能特性上實現了更均衡、更顯著的提升。有研究已證實，磷酸鹽能夠提升乳清蛋白的熱穩定性，本研究不僅驗證了這一點，同時通過SHMP與SPP的復配，從鈣離子螯合阻斷交聯與增加靜電斥力兩方面更有效地阻礙乳清蛋白在加熱過程中的變性。除此以外單一磷酸鹽改性往往難以同時優化所有功能，本研究結果表明，適宜的復配比例能同步實現熱穩定性、乳化穩定性（提升2～3?倍）和持水性（最高至90%）的提升，體現了復合磷酸鹽通過協同作用改變蛋白電荷與構象，同時對蛋白質的表面特性產生了積極影響。

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結 論

本研究系統探究了復合磷酸鹽比例、磷酸鹽濃度對乳清蛋白結構及功能特性的影響。結果證實，磷酸化修飾通過引入負電荷，顯著改變了乳清蛋白的二級結構（α-螺旋增加），并誘導乳清蛋白的微觀結構從光滑表面轉變為粗糙多孔的形態。這一結構變化與磷酸基團的靜電屏蔽、氫鍵重構及疏水相互作用密切相關，為功能特性的提升提供了理論基礎。對磷酸化乳清蛋白進行熱穩定性觀測，發現在100?℃、30?min熱處理后均未發生絮凝現象，并且加熱后濁度相較WPI90明顯較低 （P＜0.05）。在121?℃、15?min熱處理后，添加質量濃度0.06?g/100?mL、SHMP與SPP質量比為1∶2的復合磷酸鹽樣品表現出最優的動力學穩定性，表明適度的磷酸化可提供有效空間位阻對抗蛋白變性。添加復合磷酸鹽后蛋白溶解性得到不同程度的提升。而其持水性在添加質量濃度0.09?g/100?mL條件下顯著提升，可能與高熱誘導的均勻網絡結構形成有關，在低添加量（0.03、0.06?g/100?mL）時可能因為離子干擾抑制了水合作用。乳化性僅在復合磷酸鹽添加量為0.06?g/100?mL、SHMP與SPP質量比為1∶1時顯著提升，可能因該條件下蛋白吸附能力與界面張力達到平衡；而乳化穩定性在SHMP與SPP質量比為2∶1時普遍增強，歸因于SHMP的多電荷特性強化了界面的靜電穩定作用。FC在添加量0.09?g/100?mL、SHMP與SPP質量比為1∶1或1∶2時提高，但FS僅于添加量為0.06?g/100?mL、SHMP與SPP質量比為2∶1時同步改善，說明磷酸化雖能增強FC，但FS需依賴特定電荷平衡與蛋白膜強度。SHMP與SPP質量比為2∶1的復配方案在提升乳清蛋白乳化性、乳化穩定性、FS方面具有突出潛力。本研究結果可為高附加值乳制品的開發提供理論支持。

第一作者：

董暄，天津科技大學食品科學與工程學院碩士研究生。2023.09-至今：天津科技大學碩士研究生在讀；2024.03-至今：中國農業科學院農產品加工研究所進行聯合培養，完成課題研究。碩士期間研究方向為乳品加工與品質調控。

引文格式：

董暄, 路茹青, 逄曉陽, 等. 復合磷酸鹽修飾提升乳清蛋白熱穩定性與表面特性的機制[J]. 食品科學, 2026, 47(8): 104-112. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251022-160.

DONG Xuan, LU Ruqing, PANG Xiaoyang, et al. Mechanism by which modi?cation with phosphate mixtures improve the thermal stability and surface properties of whey protein isolate[J]. Food Science, 2026, 47(8): 104-112. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251022-160.

實習編輯：輝煌；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網

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