《食品科學》：江南大學何冬旭教授等：五沒食子酰葡萄糖通過影響內皮型一氧化氮合酶磷酸化改善高血壓小鼠內皮損傷的機制

高血壓作為全球性的重大公共衛生挑戰，是導致心、腦、腎等靶器官損害及心血管事件發生的主要危險因素。目前臨床常用降壓藥物包括利尿劑、β-受體阻滯劑、鈣通道阻滯劑、血管緊張素轉換酶抑制劑和血管緊張素II受體拮抗劑等。盡管這些藥物療效明確，但由于其作用靶點通常具有全身性，常伴隨一系列副作用。因此，開發特異性更強、副作用更小的新型降壓策略顯得尤為重要。

血管內皮功能障礙是高血壓發生與演進的核心病理環節。在正常生理狀態下，內皮細胞通過內皮型一氧化氮合酶（eNOS）催化生成一氧化氮（NO）。NO是維持血管舒張功能與內皮穩態的關鍵信號分子。eNOS活性受其特定位點磷酸化的精密調控。其中，Ser1177位點的磷酸化是激活該酶、促進NO生成的關鍵機制。然而，在高血壓狀態下，多種致病因素會導致eNOS（Ser1177）磷酸化水平下降。這致使NO生物利用度降低，從而加劇血管功能障礙。

近年來，天然化合物因其來源廣泛、多靶點作用及副作用較小等優勢，在心血管疾病防治領域展現出廣闊前景。已有研究報道，黃酮類、多酚類等天然成分具有改善內皮功能的潛力。槲皮素、白藜蘆醇、芹菜素等植物化學物通過靶向血管重塑、炎癥和氧化應激相關信號通路發揮抗高血壓作用。然而，傳統研究模式多依賴于大規模隨機篩選，目標性不強且效率有限。為突破這一局限，本研究創新性地采用計算機輔助藥物篩選與實驗驗證相結合的研究策略。

五沒食子酰葡萄糖（PGG）作為一種天然多酚類化合物，在抗癌、抗氧化及心血管保護等方面表現出多種生物活性，然而其與eNOS的相互作用及在高血壓中的功能研究鮮見系統報道。基于此，江南大學食品學院的楊加祥、何冬旭*和江南大學無錫醫學院的劉源綜合運用在體實驗（高血壓小鼠模型）、離體（人冠狀動脈內皮細胞（HCAEC））實驗及轉錄組測序與生物信息學分析，系統探討PGG能否精準靶向并激活eNOS，進而改善高血壓病理狀態下內皮功能障礙的作用與機制，以期為將PGG開發為靶向eNOS的潛在高血壓治療藥物奠定堅實的實驗與理論基礎。

1 靶向eNOS天然小分子的篩選及驗證

按照1.3.1節方法，基于eNOS的三維結構，利用Discovery Studio對其16 個潛在結合位點進行分子對接分析，按評分排序篩選前10 個化合物。LibDock打分前10的天然化合物依次是PGG、瓜子金皂苷V、異麥角甾苷、瓜子金皂苷己、重樓皂苷D、重樓皂苷B、管花苷A、金石蠶苷、鳳仙萜四醇苷K、趕黃草苷A。有研究表明，PGG存在于芍藥等多酚類植物中，具有改善氧化應激、降血糖及預防心血管疾病等作用。瓜子金皂苷己是從遠志科植物瓜子金（Polygala japonica）中提取的一種齊墩果烷型三萜皂苷類化合物，具有顯著的抗炎和神經保護作用。瓜子金皂苷V是從遠志科植物瓜子金中分離出的一種三萜皂苷，具有抗炎、抗菌、抗抑郁等藥理作用。異麥角甾苷是一種從植物中提取的化合物，具有抗炎特性。重樓皂苷D是從百合科植物多葉重樓中提取的一種甾體皂苷類化合物，已被證實具有顯著的抗腫瘤活性。它通過多種機制發揮抗癌作用，包括誘導細胞凋亡、抑制血管生成、激活氧化磷酸途徑等。重樓皂苷B是從重樓屬植物中提取的一種甾體皂苷類化合物，具有顯著的抗腫瘤活性，它通過多種機制發揮抗癌作用，包括誘導細胞凋亡、抑制血管生成、調節免疫反應等。管花苷A主要來源于列當科肉蓯蓉屬植物，初步研究顯示其具有抗氧化活性，可能對神經細胞有保護潛力。鳳仙萜四醇苷K屬于苯丙素類化合物，它主要存在于鳳仙花屬植物中，有報道稱其具有抗炎、抗氧化活性。金石蠶苷是從來江藤的莖和葉中分離出來的咖啡?；谋奖樘擒栈衔?，在腦缺血動物模型中表現出明確的神經保護作用。趕黃草苷A從非洲草藥中提取，在保護神經和抗腫瘤方面顯示雙重潛力。其中，PGG對接分數最高（圖2a、b），且與已知心血管相關文獻報道最多，綜合選定PGG進行后續驗證。分子對接模擬顯示PGG與eNOS結合良好（圖2c、d）。

2 PGG作用于eNOS（Ser1177）濃度與作用時間

eNOS Ser1177位點（人類為Ser1177，小鼠為Ser1179）是eNOS最關鍵的正向調控磷酸化位點，被視為激活eNOS、產生NO的“主開關”或“油門”。為模擬血管內皮細胞對高鹽引起的高血壓（鹽敏性高血壓）環境的應激，以60 mmol/L NaCl處理HCAEC細胞48 h以構建高鹽冠狀動脈內皮細胞損傷模型（高鹽HCAEC細胞）。結果顯示，高鹽處理使HCAEC細胞eNOS的Ser1177位點磷酸化水平顯著降低（P＜0.001）（圖3）。隨后，以不同濃度、不同作用時間的PGG處理細胞，檢測eNOS磷酸化的影響。

用不同濃度PGG（10、20、40 μmol/L）孵育HCAEC細胞24 h。定量分析表明，在非高鹽條件下，20、40 μmol/L PGG能使eNOS磷酸化水平提升到對照組的（1.63±0.19）、（1.71±0.33）倍（P＜0.05）（圖4a），在高鹽條件下，10、20、40 μmol/L PGG處理分別使p-eNOS/eNOS比值上升到高鹽對照組的（1.72±0.62）（P＜0.05）、（2.39±0.61）倍（P＜0.001）與（2.71±0.30）倍（P＜0.001）（圖4b），說明PGG不僅具有“保護”作用，還具有“激活”作用。

在非高鹽條件下，24 h和48 h PGG處理能使磷酸化水平顯著提升到對照組的（1.66±0.73）倍（P＜0.05）與（1.96±0.44）倍（P＜0.01）（圖4c）。在高鹽條件下，使用20 μmol/L PGG處理HCAEC不同時間（12、24、48 h），使p-eNOS/eNOS比值分別上升到高鹽對照組的（2.58±0.52）（P＜0.01）、（2.42±0.61）倍（P＜0.01）與（2.59±0.43）倍（P＜0.01）（圖4d）。

綜合濃度和時間實驗，確定20 μmol/L PGG處理24 h為后續細胞機制研究的實驗條件，此條件細胞在高鹽與正常狀態下均能顯著提高eNOS Ser1177位點磷酸化水平。

3 PGG對NO含量的影響

NO含量（尤其生物活性NO）是確認eNOS功能激活的關鍵證據。使用一氧化氮測定試劑盒檢測正常與高鹽培養條件下，用20 μmol/L PGG處理24 h前后HCAEC細胞上清液內NO水平。

如圖5所示，在高鹽狀態下，PGG能使細胞上清液NO水平由（74.9±6.81）μmol/L上升到（125.10±7.37）μmol/L （P＜0.001），在正常狀態下，PGG能使細胞上清液NO水平由（150.10±8.74）μmol/L上升到（185.30±12.34）μmol/L（P＜0.05）。這表明PGG能顯著提升正常、高鹽孵育的HCAEC細胞中NO水平。這一檢測結果與eNOS磷酸化數據關聯分析，強化PGG能使eNOS激活（表現為Ser1177位點磷酸化程度加強），進而NO釋放量增加。

4 PGG作用于eNOS（Thr495）磷酸化位點分析

eNOS Thr495位點（在人類中為Thr495，在小鼠中為Thr497）是eNOS的一個至關重要的負調控磷酸化位點。為探究PGG能否作用于eNOS（Thr495）磷酸化位點，按照1.3.6節方法，研究20 μmol/L PGG處理24 h對正常與高鹽條件下HCAEC的eNOS（Thr495）磷酸化的影響。結果表明PGG不能使eNOS（Thr495）磷酸化水平發生顯著改變，說明PGG主要作用于eNOS（Ser1177）磷酸化位點（圖6）。

5 PGG對正常小鼠主動脈血管段的舒張功能的影響

細胞學實驗結果表明，PGG能影響內皮細胞eNOS（Ser1177）磷酸化水平，進而影響eNOS活性。為了在組織水平上進行驗證，取正常小鼠的主動脈血管段進行實驗。NG-硝基-L-精氨酸甲酯（NG-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME）為eNOS特異性抑制劑，實驗分為3 組：溶劑對照組、PGG處理組（20 μmol/L PGG孵育30 min）、PGG+L-NAME組（20 μmol/L PGG+100 μmol/L L-NAME共孵育30 min），然后測定血管張力。結果顯示，PGG處理組的血管舒張程度（（84.7±4.52）%）顯著高于溶劑對照組（（74.90±4.36）%）（P＜0.05）。當加入eNOS抑制劑L-NAME后，血管舒張過程被顯著抑制（（29.60±5.03）%，P＜0.001）（圖7）。這說明，PGG改善主動脈內皮舒張功能的主要機制是激活eNOS。

6 PGG緩解小鼠高血壓進程

由圖8a、b可知，第14天，高鹽飲食對照組小鼠血壓升高，但是接受了PGG灌胃的小鼠血壓呈現降低趨勢；第35天，PGG灌胃組小鼠平均收縮壓（（111.00±1.52）mmHg）、平均舒張壓（（91.00±1.43）mmHg）顯著低于高鹽對照組（平均收縮壓（124.00±1.62）mmHg、舒張壓（103.00±1.48）mmHg，P＜0.001）。因此，結果提示PGG可以緩解小鼠高血壓進程。通過對PGG灌胃組與高鹽對照組小鼠分離主動脈原代內皮細胞，發現PGG灌胃組eNOS磷酸化顯著上升（圖8c），PGG灌胃組p-eNOS/eNOS比值為高鹽對照組的（2.05±0.43）倍（P＜0.001），表明PGG對eNOS具有較好激活作用。

離體微血管張力實驗可通過測定小鼠的血管內皮依賴性舒張，揭示血管內皮受損與功能性障礙。與高鹽對照組相比，灌胃后的疾病小鼠主動脈內皮依賴性舒張程度由（47.82±5.51）%升至（64.33±4.62）%（P＜0.05）（圖8d）。結果提示，PGG有效緩解了高血壓小鼠的主動脈舒張障礙。

7 PGG改善高血壓小鼠主動脈段內皮損傷的機制探究

為深入解析主動脈內皮細胞和PGG互作過程中涉及的與eNOS激活相關的通路，將高血壓對照組小鼠與PGG灌胃組的主動脈血管段基于Illumina/MGI測序平臺進行轉錄組雙端測序（n＝3），使用鏈特異性建庫。對測序結果進行質控與過濾，使用FastQC評估原始數據質量，Cutadapt過濾低質量序列。6 個樣品的轉錄組分析共獲得17.11 Gb的CleanData，各樣品CleanData均達到2.54 Gb以上，Q30堿基百分比在96.62%以上，GC含量穩定，數據質量高。對測序結果CleanData進行后續生物信息學分析。

將高鹽對照組與PGG灌胃組主動脈血管段的CleanData使用DESeq2軟件進行組間差異基因分析，獲得兩組間發生差異表達的基因（|log2差異倍數|＞1、P＜0.05），共發現200 個差異基因，其中154 個顯著上調基因，46 個顯著下調基因（圖9a），基因熱圖如圖9b所示。

對這些基因進行基因本體論（GO）（圖9c）與差異基因表征的顯著性水平P值（圖9d）分析。在生物過程方面，差異基因在B細胞受體信號通路、先天免疫應答、補體激活（經典途徑）和乙酰輔酶A代謝過程等過程方面顯著富集。在細胞組分方面，差異基因在質膜和質膜外側等部位顯著富集。在分子功能方面，差異基因顯著富集于抗原結合、免疫球蛋白受體結合和蘋果酸脫氫酶（脫羧，NAD+）活性（NAD+依賴性蘋果酸酶）等功能。

同時，對差異基因進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析，發現在KEGG代謝過程中，丙酮酸代謝、丙酸代謝、脂肪酸代謝、脂肪酸生物合成、皮質醇合成與分泌、鈣信號通道等過程都顯著富集（圖9e、f）。總之，上述差異基因功能富集結果可作為PGG改善eNOS磷酸化潛在機制探索的重要切入點。

8 PGG靶向對NAD+/NADH活性的影響

轉錄組學是發現性工具，為機制研究提供了線索和方向（如指向能量代謝），但具體的因果鏈條需要后續靶向實驗驗證。通過對上述差異基因功能富集結果提示（如KEGG富集到的丙酮酸代謝、脂肪酸代謝等，GO富集到的蘋果酸脫氫酶（脫羧）（NAD + ）活性代謝過程），PGG灌胃后，相當部分能量代謝相關通路被激活，于是后續重點關注與eNOS磷酸化相關的能量代謝通路。β-拉杷醌可通過激活NQO1提升NAD + /NADH比值，進而促進eNOS Ser1177磷酸化，提高NO的釋放，使血管舒張并降低血壓。其中NAD + 是細胞代謝的中心樞紐和關鍵調節因子，其水平直接決定細胞的能量產出效率、代謝適應性和整體健康狀態。

因此，研究PGG是否通過類似機制發揮作用，檢測20 μmol/L PGG孵育24 h對正常HCAEC以及高鹽HCAEC NAD + /NADH比值的影響。結果顯示，正常細胞中，PGG處理組NAD + /NADH比值（11.51±1.40）顯著高于對照組（8.50±0.80）（P＜0.05）；高鹽細胞中，PGG處理組比值（5.35±0.33）亦顯著高于高鹽對照組（2.67±0.32）（P＜0.001）（圖10）。因此，結果提示PGG可以顯著提升內皮細胞NAD + /NADH比值，并激活下游通路。

9 PGG對Nampt含量的影響

Nampt是哺乳動物體內NAD + 生物合成補救途徑中的限速酶和關鍵調控因子，直接決定了細胞內NAD + 的水平。為了進一步探究PGG→NAD + /NADH的上游機制，通過Nampt ELISA試劑盒檢測正常與高鹽培養條件下HCAEC細胞用20 μmol/L PGG處理24 h后細胞上清液中Nampt水平。如圖11所示，在高鹽狀態下，PGG能使細胞上清液Nampt水平由（7.35±0.39）μg/mL 上升到（12.56±0.71）μg/mL（P＜0.001），在正常狀態下，PGG能使細胞上清液Nampt水平由（14.97±0.88）μg/mL上升到（18.87±1.79）μg/mL （P＜0.05）。這表明PGG能顯著提升正常、高鹽孵育的HCAEC細胞中Nampt水平。這一檢測結果與PGG調控NAD + /NADH比值上升關聯分析，建立內皮功能的一個潛在核心機制“PGG→Nampt提升→NAD + /NADH比值增加→p-eNOS Ser1177位點磷酸化→NO合成→血管舒張功能改善與血壓降低”的邏輯鏈條，為NAD + /NADH上游機制驗證提供支持。這也為理解天然多酚如何通過調節細胞代謝穩態發揮心血管保護作用提供了新的實驗框架和分子線索。

10 討論與結論

本研究揭示，天然小分子化合物PGG可通過提升eNOS Ser1177位點的磷酸化水平，進而激活eNOS、促進NO生成，最終改善高血壓小鼠血管內皮依賴性舒張功能并降低血壓。其潛在機制可能為：PGG上調細胞內Nampt表達，提高NAD+/NADH水平，從而靶向增強eNOS（Ser1177）磷酸化，即遵循“PGG→Nampt提升→NAD+/NADH比值增加→p-eNOS Ser1177位點磷酸化→NO合成→血管舒張功能改善與血壓降低”的邏輯鏈條。該發現為高血壓及相關血管內皮損傷的治療提供了新的思路與潛在藥物靶點。

盡管槲皮素、白藜蘆醇與EGCG等經典植物多酚可通過磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/ 蛋白激酶B（Akt）通路、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）通路或沉默信息調節因子1通路等不同通路激活eNOS，且PGG同樣富含酚羥基結構，可能具有類似作用機制，但本研究提示其通過NAD+/NADH代謝調控eNOS激活可能為一新特征。然而，該通路的具體環節尚需進一步驗證與完善，未來研究可從以下幾方面深入：

1）作用靶點與直接互作驗證：利用表面等離子共振或等溫滴定量熱法等技術，直接檢測PGG是否與eNOS蛋白發生物理結合，從而明確其是否為直接作用靶點，深入闡明藥物-蛋白互作機制。

2）上下游信號通路的系統解析：需進一步考察PGG對eNOS上游關鍵激酶（如Akt與AMPK）磷酸化狀態的影響。若變化不顯著，則應探索其是否通過影響eNOS與其他調控蛋白的相互作用或修飾狀態（如乙?；┌l揮作用。同時，對NAD+合成途徑中的其他關鍵組分，如煙酰胺單核苷酸及其腺苷酰轉移酶，以及使用特異性抑制劑進行通路阻斷實驗，將有助于完整描繪該調控網絡。

3）轉化應用與安全性評價：目前有力證據多源于細胞與動物實驗，所用劑量遠高于日常膳食攝入。未來需開展大規模、長期的人體臨床試驗，以明確其作為膳食補充劑的有效劑量與形式。此外，PGG的口服生物利用度、體內代謝途徑及高劑量長期使用的安全性尚待系統評估，可借鑒槲皮素、白藜蘆醇等同類物的發展經驗（如制劑優化、與增效劑聯用），以提升其應用可行性。

綜上，本研究初步揭示了PGG通過Nampt-NAD+/NADH軸激活eNOS、改善血管功能的新機制，為心血管保護提供了新的候選分子。后續需圍繞靶點驗證、通路細化及轉化研究開展深入工作，以推動其向臨床應用的轉化。

作者簡介

通信作者：

何冬旭，博士，江南大學食品學院教授，博士生導師，江蘇省“六大人才高峰”計劃入選者。2007年7月獲山東大學生命科學學士學位，2011年12月獲香港中文大學生物醫學博士學位。2012年1月起任江南大學生物工程學院副教授，2017年5月晉升為教授，2018年1月轉任食品學院教授?，F任國際期刊《Cancer Studies》副主編，兼任《FEBS Journal》《OncoTargets and Therapy》等期刊審稿人。

主要從事食品營養與健康研究，聚焦食藥同源食物對心血管健康、機體穩態的分子機制，探索腸道菌群調控免疫炎癥疾病的干預策略。結合醫學生物學、微生物學、食品科學等學科領域的理論與技術，開展微環境與信號通路、營養-生理與遺傳-健康方面的研究工作，尤其在食藥同源的食物影響哺乳動物細胞增殖、心血管健康和機體穩態的分子機制研究方面取得了一定成績。主持國家自然科學基金青年、面上、應急項目及省部級課題，闡明大豆皂甙調節腸道菌群改善高血壓的機制，揭示蒙花苷靶向內凝集蛋白1改善糖尿病血管內皮功能障礙的作用。在《EMBO Molecular Medicine》《PNAS》等期刊發表SCI論文19 篇，獲中國發明專利3 項。研究成果獲江蘇省科學技術獎三等獎、江蘇省藥理科學技術獎一等獎。

第一作者：

楊加祥，江南大學食品學院2023級食品工程專業碩士研究生，研究方向為食藥同源食物對心血管健康及機體穩態的分子機制。2019年7月畢業于合肥工業大學食品科學與工程專業，獲工學學士學位。本科期間獲評“合肥工業大學優秀學生干部”，研究生階段榮獲江南大學研究生二等獎學金。

引文格式：

楊加祥, 劉源, 何冬旭. 五沒食子酰葡萄糖通過影響內皮型一氧化氮合酶磷酸化改善高血壓小鼠內皮損傷的機制[J]. 食品科學, 2026, 47(9): 179-189. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251126-201.

YANG Jiaxiang, LIU Yuan, HE Dongxu. 1,2,3,4,6-Penta-O-galloyl-β-D-glucose ameliorates endothelial injury in hypertensive mice by affecting eNOS phosphorylation: a mechanistic study[J]. Food Science, 2026, 47(9): 179-189. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251126-201.

實習編輯：普怡然；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網

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