FSHW | 基于肽組學與宏基因組學揭示發(fā)酵蠶豆醬中鮮味肽的形成機制

本文系Food Science and Human Wellness原創(chuàng)編譯，歡迎分享，轉(zhuǎn)載請授權(quán)。

Abstract

鮮味肽在發(fā)酵蠶豆醬（fermented broad bean paste，F(xiàn)BBP）的風味形成中起著重要作用，而微生物產(chǎn)生的蛋白酶是鮮味肽生成的關鍵因素。為揭示FBBP自然發(fā)酵過程中鮮味肽的形成規(guī)律及其與產(chǎn)蛋白酶微生物之間的關系，本研究采用肽組學結(jié)合虛擬篩選技術(shù)對鮮味肽進行鑒定與篩選；同時，利用宏基因組學分析FBBP發(fā)酵過程中微生物來源蛋白酶基因的豐度變化。進一步基于Pearson相關系數(shù)，構(gòu)建了各產(chǎn)蛋白酶微生物與鮮味肽之間的相關性網(wǎng)絡圖。

結(jié)果表明，在FBBP中共注釋到2種外肽酶和4種內(nèi)肽酶，其中Staphylococcus、Lactobacillus、Aspergillus和Weissella是主要的蛋白酶產(chǎn)生菌屬。Lactobacilluscurvatus、Dyellajiangningensis、Erythrobacter sp.以及未分類的Pantoea屬（unclassified_g_Pantoea）與鮮味肽表現(xiàn)出較強的相關性，可能在蛋白質(zhì)水解并生成鮮味肽的過程中發(fā)揮重要作用。

本研究有助于闡明FBBP中鮮味肽的形成機制，加深對蛋白酶、微生物群落與核心鮮味肽之間關系的理解，為發(fā)酵過程中提升郫縣豆瓣醬的鮮味品質(zhì)提供理論依據(jù)。

Introduction

郫縣豆瓣醬（Pixian Douban paste，PDBP）是中國最受歡迎的調(diào)味品之一，也是川菜不可或缺的基礎調(diào)料。其以辣椒和蠶豆醬按一定比例配制，并經(jīng)發(fā)酵釀制而成。其中，蠶豆醬的發(fā)酵過程是決定郫縣豆瓣醬風味和品質(zhì)的關鍵環(huán)節(jié)。發(fā)酵蠶豆醬（FBBP）以蠶豆和小麥粉為主要原料，在微生物代謝產(chǎn)生的酶作用下，被分解生成風味肽、風味氨基酸、單糖以及酸、醇、酯等多種揮發(fā)性風味物質(zhì)。近年來，鮮味肽因其良好的口感特性和較高的營養(yǎng)價值而受到廣泛關注，是風味的重要組成部分。

發(fā)酵過程中，微生物代謝（如蛋白水解和脂類水解）決定了風味物質(zhì)的種類和含量，微生物群落在原料降解和風味形成中發(fā)揮著不可替代的作用。其中，微生物產(chǎn)生的蛋白酶通過催化蛋白質(zhì)水解生成鮮味肽。然而，目前關于蠶豆發(fā)酵過程中鮮味肽的變化及其產(chǎn)蛋白酶微生物之間的關系仍缺乏系統(tǒng)研究。

因此，本研究結(jié)合肽組學與虛擬篩選技術(shù)鑒定FBBP中的鮮味肽，并利用宏基因組學分析發(fā)酵過程中微生物來源蛋白酶基因的豐度變化，進一步通過相關性分析揭示鮮味肽、蛋白酶及微生物來源之間的關系，為提升發(fā)酵蠶豆醬及郫縣豆瓣醬的鮮味品質(zhì)提供理論依據(jù)。

Results and Discussion

肽的鑒定

鮮味肽的篩選

肽的味覺特性與其氨基酸組成、排列順序及分子量密切相關。已有研究表明，鮮味肽多為小分子肽，尤其是分子量低于1000 Da的肽通常具有較強的鮮味特性。鮮味肽中常富含天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）、天冬酰胺（N）和谷氨酰胺（Q），這些氨基酸及其組合被認為是鮮味形成的重要結(jié)構(gòu)基礎。

基于上述特征，本研究以分子量＜1000 Da且D、E、N、Q含量≥30%為篩選標準，從FBBP中共篩選得到377條游離肽。主成分分析結(jié)果顯示，隨著發(fā)酵時間延長，各組之間差異逐漸增大，其中D90組與其他組差異最為顯著，而D0與D30組差異相對較小（圖1a）。不同發(fā)酵階段肽的數(shù)量隨發(fā)酵時間明顯增加，D0、D30、D60和D90組分別檢測到98、161、250和352條肽，其中D60與D90組具有較多共有肽（圖1b）。肽的分子量主要集中在0.25～0.5 kDa區(qū)間，且各分子量區(qū)間的肽數(shù)量均隨發(fā)酵時間增加而上升（圖1c）。

進一步結(jié)合iUmami-SCM與PeptideRanker進行虛擬篩選，最終共鑒定出269條潛在鮮味肽，其豐度變化如圖2所示。結(jié)果表明，與未發(fā)酵組相比，發(fā)酵組中鮮味肽豐度顯著提高，且隨發(fā)酵時間延長呈上升趨勢。預測結(jié)果顯示，該篩選方法的準確率為71.35%，表明肽組學結(jié)合虛擬篩選在鮮味肽篩選中具有較高的可靠性。

圖1 不同發(fā)酵時間FBBP中鮮味肽的鑒定

圖2 不同發(fā)酵時間鮮味肽的熱圖分析

篩選鮮味肽的組成特征

為進一步明確鮮味肽的結(jié)構(gòu)特征，對其氨基酸組成進行了分析。結(jié)果顯示，篩選得到的鮮味肽以短肽為主，其中三肽占比最高，其次為四肽和二肽（圖3a），與已報道的多種食品體系中鮮味肽的組成特征一致。

氨基酸組成分析表明，D和E在鮮味肽中出現(xiàn)頻率最高，其次為L、N、V、P、A、S和G（圖3b）。已有研究表明，除D、E、N、Q外，V、P及甜味氨基酸（A、S、G）亦可協(xié)同增強肽的鮮味特性，這可能是這些肽具有鮮味的重要原因之一。此外，N端和C端氨基酸分析結(jié)果顯示，D和E均為主要末端氨基酸殘基（圖3c）。部分肽同時具有酸性氨基酸與堿性氨基酸的特定末端組合結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在以往研究中已被證實與較強鮮味特性相關。

圖3 篩選得到的鮮味肽組成分析

FBBP中的微生物蛋白酶

FBBP中蛋白酶的類型與分布

鮮味肽是FBBP風味的重要組成部分，而微生物蛋白酶是其生成的關鍵催化因素。宏基因組學分析顯示，F(xiàn)BBP中共注釋到來源于39個微生物屬的多種蛋白酶基因，主要包括外肽酶和內(nèi)肽酶。外肽酶主要為氨肽酶和羧肽酶，內(nèi)肽酶則包括絲氨酸內(nèi)肽酶、金屬內(nèi)肽酶、天冬氨酸內(nèi)肽酶和半胱氨酸內(nèi)肽酶。

不同發(fā)酵階段蛋白酶基因豐度變化如圖4所示。結(jié)果表明，發(fā)酵后期（D90）氨肽酶、羧肽酶和絲氨酸內(nèi)肽酶為主要蛋白酶類型，其豐度分別占總蛋白酶含量的較大比例。蛋白酶豐度隨發(fā)酵時間呈先下降后上升趨勢，并在D90達到峰值，該變化趨勢與產(chǎn)蛋白酶微生物豐度變化基本一致（圖5）。

圖4 不同發(fā)酵時間蛋白酶的變化情況

外肽酶和內(nèi)肽酶的微生物來源

氨肽酶和羧肽酶主要由Staphylococcus、Lactobacillus、Weissella、Bacillus_f__Bacillaceae等屬微生物產(chǎn)生（圖5）。內(nèi)肽酶中，絲氨酸內(nèi)肽酶和金屬內(nèi)肽酶分布最為廣泛，主要由Staphylococcus、Lactobacillus、Aspergillus和Weissella等屬產(chǎn)生。綜合分析表明，上述微生物屬是FBBP中蛋白酶的主要來源，同時也是郫縣豆瓣醬發(fā)酵過程中占優(yōu)勢的核心微生物。

圖5 D0、D30、D60和D90組中不同蛋白酶微生物來源豐度的變化

FBBP鮮味肽與蛋白酶的相關性分析

選取篩選后豐度排名前50的鮮味肽作為FBBP的核心鮮味肽，與主要產(chǎn)蛋白酶微生物進行Pearson相關性分析（圖6），并進一步構(gòu)建相關性網(wǎng)絡圖（圖7）。結(jié)果顯示，多種產(chǎn)蛋白酶微生物與鮮味肽之間存在顯著正相關關系。其中，Lactobacillus curvatus、Dyella jiangningensis、Erythrobacter sp.及unclassified_g__Pantoea與鮮味肽的相關性最強，表明這些微生物可能在核心鮮味肽的生成過程中發(fā)揮關鍵作用。

圖6 核心鮮味肽與豐度排名前50的產(chǎn)酶微生物物種相關性聚類熱圖

圖7 核心鮮味肽與產(chǎn)酶物種的相關性網(wǎng)絡圖

Conclusion

本研究基于肽組學與虛擬篩選技術(shù)，從 FBBP 中系統(tǒng)鑒定了鮮味肽，并結(jié)合宏基因組學分析揭示了其形成過程中微生物蛋白酶的作用機制。結(jié)果表明，F(xiàn)BBP中富含多種微生物來源的蛋白酶，其中氨肽酶、羧肽酶和絲氨酸內(nèi)肽酶是鮮味肽形成的主要酶類。相關性分析顯示，24種產(chǎn)蛋白酶微生物與鮮味肽顯著相關，其中L. curvatus、D. jiangningensis、Erythrobacter sp.和unclassified_g__Pantoea可能是FBBP核心鮮味肽形成的關鍵功能菌群。本研究為闡明FBBP鮮味肽的形成機制及優(yōu)化郫縣豆瓣醬發(fā)酵風味提供了理論依據(jù)。

Revealing the formation mechanism of umami peptides in fermented broad bean paste based on peptidomics and macrogenomics

Yuqing Xiea, Jianhua Zhaoa, Binbin Zhoua, Ping Liuc, Jie Zhaob, Min Xuc, Jiaxin Chenc, Hongbin Lina,b,*, Jie Tangc,*

a School of Food and Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China

b Food Microbiology Key Laboratory of Sichuan Province, Chengdu 610039, China

c Chongqing Key Laboratory of Specialty Food Co-built by Sichuan and Chongqing, Chengdu 610039, China

*Corresponding author.

Abstract

Umami peptides play important roles in the flavor of fermented broad bean paste (FBBP), and proteases produced by microorganisms contributed to the production of umami peptides. In order to reveal the formation of umami peptides and their relationships with protease-producing microorganisms during the natural fermentation of FBBP, peptidomics and virtual screening were used to identify and screen umami peptides. Meanwhile, macrogenomics was used to analyze the abundance of microbial-derived protease genes during FBBP fermentation. Then, based on the Pearson correlation coefficient, the correlation network diagram of each protease-producing microorganism with umami peptides was constructed. The results showed that a total of two exopeptidases and four endopeptidases were annotated from FBBP. Staphylococcus, Lactobacillus, Aspergillus, and Weissella can produce most proteases. The species Lactobacillus curvatus, Dyella jiangningensis, Erythrobacter sp., and unclassified_g_Pantoea had strong correlation with umami peptides, and they may contribute to the process of protein hydrolysis to produce umami peptides. This study is expected to reveal the formation mechanism of umami peptides in FBBP, and the results of this study provided a better understanding of the relationship between proteases, microbiota, and core umami peptides in FBBP, which could help to improve the umami taste of Pixian Douban paste during fermentation.

Reference:

XIE Y Q, ZHAO J H, ZHOU B B, et al. Revealing the formation mechanism of umami peptides in fermented broad bean paste based on peptidomics and macrogenomics[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(7): 9250296. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250296.

翻譯：王小云（實習）

編輯：梁安琪；責任編輯：孫勇

封面圖片：攝圖網(wǎng)

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