北京
乳清蛋白是牛乳中的一種重要蛋白質，具有較高的營養價值和較好的功能特性。然而，乳清蛋白在高溫、高蛋白濃度條件下易發生凝固、沉淀和氧化等問題，限制了其在高蛋白飲料、運動食品、特醫食品等領域的應用。研究表明，乳清蛋白溶液經85 ℃以上的熱處理會發生變性和聚集，并且在超過10%的蛋白質含量條件下，往往會形成熱誘導凝膠。因此，提高乳清蛋白的耐熱性仍然是一個嚴峻的挑戰。
磷酸鹽是指由磷酸（ H 3 PO 4 ）和金屬離子形成的一類無機化合物，作為食品添加劑（如增稠劑、穩定劑、乳化劑）廣泛應用于奶制品、肉制品、速凍食品和調味品中。有研究表明，磷酸鹽可以通過螯合金屬離子有效提高含乳清蛋白溶液的熱穩定性，使乳清蛋白在140 ℃條件下熱絮凝時間增加了10～30 min，這使其在加熱處理時更穩定，能保持其結構和功能特性。對乳清蛋白進行熱處理是一種常見的物理改性方法，通過改變加熱時間、溫度、pH值以及鹽離子使其具有不同的特性。加熱可以促進磷酸化程度，干熱磷酸化已經被開發應用于蛋白改性中。有研究發現，在特定的磷酸化條件下濕熱改性增加了乳清蛋白的持水性。增強持水性可以保持蛋白質的水合狀態，能夠阻止蛋白質在加熱過程中由失水引起的變性和不穩定性。
天津科技大學食品科學與工程學院的董暄、李紅娟*和中國農業科學院農產品加工研究所的張書文*等人以乳清分離蛋白（WPI90）和多種磷酸鹽為原料，在不同溫度和pH值條件下對乳清蛋白進行濕熱磷酸化改性，系統探究多個磷酸鹽在不同制備條件下通過濕熱磷酸化改性對乳清蛋白熱穩定性的影響，以解決高濃度乳清蛋白難以通過超高溫滅菌處理或在加熱過程中發生絮凝沉淀的問題。通過評價不同磷酸鹽和加熱溫度對改性后乳清蛋白溶解性及熱穩定性的影響，從而得到提高乳清蛋白熱穩定性適宜的磷酸化條件，為后續進行高蛋白飲料產品開發提供現實依據。
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磷酸化乳清蛋白熱穩定性的宏觀結果
分別選取STPP、SHP、DSP、SHMP、SPP在不同pH值（6.8、7.0、7.2）和溫度（75、80、85 ℃）條件下進行濕熱磷酸化改性，觀察對高濃度乳清蛋白溶液熱穩定性的影響。由圖1可知，DSP組在溫度和pH值范圍內均出現熱凝固現象。STPP組、SHP組、SPP組在pH 6.8條件下出現流動性降低、黏度增大的現象，并且STPP組在pH 7.2條件下形成了不透明凝膠。在pH 7.0的3 個溫度條件下，STPP、SHP、SHMP、SPP的添加能夠有效抑制熱絮凝的發生。Mariana等也同樣發現在pH 7.0條件下，添加SHMP的乳清蛋白熱穩定性得到提升。結果表明，特定的磷酸化條件在一定程度上可以有效提高乳清蛋白的熱穩定性，表現出與微粒化乳清蛋白（WPC550）相近的耐熱特性。故選取在pH 7.0所有溫度范圍內添加STPP、SHP、SHMP、SPP的磷酸化條件作進一步探究。
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游離巰基含量分析
如圖2所示，磷酸化后乳清蛋白游離巰基的含量變化較為明顯，在不同溫度條件下添加SHP制備得到的磷酸化蛋白游離巰基含量較WPI90均呈現出上升趨勢，這可能是由于SHP通過其高離子強度以及可能發生的共價修飾破壞了乳清蛋白（WPI90）的天然緊密結構，使其發生去折疊，將原本包埋在蛋白質分子內部的游離巰基暴露到了分子表面。在制備溫度75 ℃條件下，STPP、SHP、SHMP組的游離巰基含量高于WPI90組，這可能是由于大部分鏈狀的磷酸鹽可以與乳清蛋白上含氨基或羥基的絲氨酸或者蘇氨酸結合，而與含巰基的半胱氨酸結合較差，因此促進了游離巰基暴露。對照WPC550的游離巰基含量顯著高于磷酸化蛋白（
P＜0.05），這是由于微粒化蛋白在制備過程中首先使蛋白發生熱聚集隨后對其進行機械處理，導致游離巰基暴露至蛋白質分子表面，分子間的游離巰基與二硫鍵發生了交換反應，形成分子間二硫鍵，使微粒之間發生交聯，從而粒徑增大，沉淀率升高，溶解度降低。
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表面疏水性分析
表面疏水性是衡量蛋白質鏈中疏水性氨基酸暴露程度的指標。如圖3所示，相較于對照WPI90，在75 ℃條件下添加不同磷酸鹽制備的磷酸化乳清蛋白，表面疏水性整體降低，可能是由于添加了磷酸鹽后，磷酸基團與乳清蛋白氨基酸殘基發生結合，增加了蛋白表面凈負電荷，使蛋白質表面的疏水性氨基酸殘基更容易與水發生結合，從而降低表面的疏水性。而在85 ℃條件下制備的磷酸化蛋白暴露出更多的疏水部分，這種效應可能是由于在85 ℃條件下，較高的溫度使乳清蛋白結構部分展開，磷酸基團與蛋白質的共價結合固定構象部分展開，疏水殘基被暴露在蛋白表面，從而增加了表面疏水性。對照WPC550具有最高的表面疏水性，這是由于微粒化蛋白在加工過程中變性程度大，破壞了蛋白質的三級結構，使疏水殘基暴露至表面，導致表面疏水性增加，這些暴露的疏水基團會相互結合，形成不溶性聚集體，從而降低蛋白的溶解性。
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鈉磷鈣鹽含量分析
如表2所示，添加不同的磷酸鹽后蛋白體系中的鈉和磷含量較未改性樣品WPI90顯著增加（
P＜0.05），其中，SHP組的鈉和磷含量與對照WPC550最接近。理論上，SHMP攜帶的鈉和磷更多（6 個），SHP攜帶的鈉和磷相對較少（1 個），但結果顯示STPP組的鈉和磷含量最高，SPP組的鈉和磷含量最低，這可能是由于STPP屬于線性結構，而SHMP是環狀結構，因此其鈉和磷的含量低于理論值；SPP攜帶的 P 2 O 7 4－ 具有較高的穩定性，不易被水解釋放磷，因此鈉和磷含量都較少。相比較對照WPI90，磷酸化蛋白整體的可溶性鈣和總鈣含量更低（
P＜0.05）。鈣含量的減少能夠使蛋白在加熱過程中的絮凝情況減少。結果表明，磷酸鹽對蛋白體系中的金屬離子均有不同程度的螯合作用，這與李妍等的研究結論一致，但磷酸鹽的螯合作用并不是提高蛋白熱穩定性的唯一機制。其中SHP和SPP對鈣離子的螯合作用更大，這可能是由于SHP攜帶的 H 2 PO 4 － 可以在中性條件下解離為 HPO 4 2－ ， HPO 4 2－ 能夠與 Ca 2＋ 形成可溶性絡合物（ CaHPO 4 ），SPP攜帶的 P 2 O 7 4－ 是非剛性結構，能與 Ca 2＋ 形成穩定的環狀螯合物，因此二者對鈣離子的螯合作用更強。雖然理論上SHMP的螯合能力最強，但其環狀結構需要先解離為線性結構才能更有效地螯合，因此在短時處理中螯合效率低。
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蛋白二級結構分析
添加磷酸鹽后乳清蛋白的二級結構發生了明顯的改變。Hu Zhenying等證實磷酸化處理可以改變蛋白的二級結構。擬合得到的二級結構含量結果見表3。與未改性的WPI90相比，磷酸化后的乳清蛋白
-折疊相對含量整體顯著降低（P＜0.05），而-轉角相對含量增加，這與Yan Chunjun等研究磷酸化蛋白二級結構結論一致。這是可能由于磷酸化結合位點主要發生在-折疊和無規卷曲上，會破壞-折疊的氫鍵，從而使磷酸化后-折疊含量降低。磷酸化引入了磷酸基團，磷酸基團帶有強的負電性，增加了分子間的排斥力，使蛋白構象更松散，促進了-轉角的形成。-螺旋位于疏水中心，其中-螺旋增多可能意味著磷酸化后蛋白通過重構疏水相互作用增加了熱穩定性。相較于對照WPI90和WPC550，在75 ℃磷酸化條件下，無規卷曲相對含量均發生了不同程度的增加，這可能是由于在75 ℃條件下乳清蛋白發生了部分變性，并且磷酸化使得蛋白內部結構發生改變，無規卷曲含量增加。
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磷酸化乳清蛋白熱穩定性分析
6.1 UHT處理后的離心沉淀率變化
離心沉淀率是反映乳清蛋白溶液聚集性的直接指標，其越低表明乳清蛋白溶液體系越穩定，不同磷酸鹽對乳清蛋白熱穩定性的提升效果取決于其電荷密度、螯合能力及與蛋白質的相互作用機制。如圖4所示，在不同制備溫度下添加SHMP所制備得到的磷酸化蛋白離心沉淀率較低，均小于10%，這可能由于SHMP是環狀多聚體磷酸鹽，含有6 個磷酸基團，在與乳清蛋白相互作用時能提供更多磷酸化位點，從而與蛋白形成更緊密的網絡狀結構，使乳清蛋白的熱穩定性顯著提高。在75 ℃和80 ℃條件下制備得到的磷酸化蛋白較85 ℃的蛋白離心沉淀率更低。這可能由于在75 ℃和80 ℃條件下，乳清蛋白的結構部分展開，暴露出更多的氨基酸修飾位點，而較高的溫度（85 ℃）能夠加速多聚磷酸鹽分解為單體磷酸鹽，從而降低了乳清蛋白與磷酸鹽的交聯作用。Wang Xuewei等的研究也同樣表明，溫度越高越有利于多聚磷酸鹽的水解。對照WPC550在加熱前為流動性極好的乳狀液，由于在加熱過程中蛋白顆粒會因受熱發生溶脹，因此沉淀率較高。
6.2UHT處理后的黏度變化
圖5、6為不同制備條件下的磷酸化乳清蛋白在UHT處理前后表觀黏度與剪切速率的關系。在UHT處理前，4 種磷酸鹽組在所有溫度條件下均表現出較低的表觀黏度，而在熱處理后均出現了黏度增大的現象，這是因為經過UHT處理后乳清蛋白發生熱變性聚集，蛋白分子間摩擦力增大，流動性變差，從而導致黏度增大。WPC550具有優異的耐熱特性，因此加熱后的高蛋白溶液表觀黏度仍較小。在熱處理前，最低和最高的表觀黏度分別對應SHMP組和SHP組。Mariana等發現在乳飲料中加入一定濃度的SHMP可以降低體系的黏度。在熱處理后，在75 ℃和80 ℃條件下添加SHMP制備得到的磷酸化乳清蛋白溶液仍具有最低的表觀黏度，表現出與WPC550相近的熱穩定性。而在85 ℃條件下，SHMP組和STPP組的表觀黏度明顯增大，乳清蛋白溶液的熱穩定性較75 ℃和80 ℃條件下有所降低，這與6.1節的結果相印證。
6.3UHT處理后的粒徑變化
粒徑能夠反映乳清蛋白顆粒的體積，熱處理后粒徑越小，說明乳清蛋白溶液的熱穩定性越好。由表4可知，UHT處理前的粒徑整體較小（＜10 μm），而UHT處理后的粒徑明顯增大，這表明熱處理會導致乳清蛋白發生聚集反應。對照WPC550在熱處理前粒徑大于其他樣品，這是由在加工過程中先加熱聚集隨后剪切所導致，形成了較大的顆粒。有研究表明，溶液體系的表觀黏度與粒徑具有相關性，粒徑越大表觀黏度越大。SHMP組的磷酸化乳清蛋白經UHT處理后仍能保持較好的穩定性，其粒徑相對較小，約為10 μm，與WPC550粒徑相近，說明添加SHMP協同短時加熱能有效提高乳清蛋白的熱穩定性，降低乳清蛋白溶液體系的粒徑。Guo等的研究也同樣表明，濕熱磷酸化可以減小顆粒的粒徑。而SPP組經UHT處理后整體粒徑較大，約為20 μm，粒徑與乳清蛋白溶液的表觀黏度變化基本趨于一致。
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磷酸化乳清蛋白的溶解性分析
溶解性是乳清蛋白的重要功能特性，磷酸化乳清蛋白的溶解性受磷酸鹽濃度、pH值、加工手段等多種因素的影響。如圖7所示，與WPI90相比，添加SHMP的部分磷酸化蛋白溶解度呈現出降低的趨勢，這是由于SHMP酸性更強，添加SHMP后，乳清蛋白的等電點可能會向酸性方向發生偏移，從而使乳清蛋白的溶解性降低。除添加SHMP的磷酸化乳清蛋白以外，其他磷酸鹽組在75 ℃條件下溶解度均得到提升。在75 ℃和80 ℃條件下SPP組的溶解度較85 ℃條件下更高，這可能是由于加熱易促進蛋白質分子間的交聯，會導致部分蛋白質發生熱聚集，從而形成二聚體，使其在冷卻后仍然難以溶解，降低了蛋白的溶解度。對照WPC550具有較低的溶解度，顯著低于與其他組（
P＜0.05），這是由于微粒化乳清蛋白在制備過程中發生了90%以上的變性，氫鍵發生破壞，蛋白質與水之間的相互作用減弱，造成溶解性下降。
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結論
本實驗采用濕熱磷酸化法改性乳清蛋白，綜合評價不同磷酸化條件制備得到的乳清蛋白溶解性與熱穩定性，并與微粒化乳清蛋白WPC550進行比較。結果顯示，經過濕熱磷酸化改性，乳清蛋白的內部結構和性能發生改變，在75 ℃的制備溫度條件下，添加STPP和SHP得到的磷酸化乳清蛋白游離巰基含量相比于WPI90呈現不同程度的增加；在該制備溫度下添加不同磷酸鹽的乳清蛋白表面疏水性相比于WPI90有所降低。添加磷酸鹽后，蛋白體系中的可溶性鈣和總鈣含量均減少，其中SPP和SHP的可溶性鈣含量最低（＜3 mg/g），磷酸化乳清蛋白的鈉和磷含量均有所增加，SHP組的鈉和磷含量與WPC550最接近。通過磷酸化修飾，乳清蛋白的二級結構均發生改變，磷酸化后的乳清蛋白
-折疊含量整體降低，而-轉角含量增加，并且在85 ℃條件下制備的樣品無規卷曲含量有所上升。除添加SHMP的磷酸化乳清蛋白以外，其他磷酸鹽組在75 ℃條件下溶解性均得到提升，其中SPP組在75 ℃和80 ℃條件下的溶解性比85 ℃條件下好。添加SHMP在75 ℃和80 ℃條件下制備得到的磷酸化蛋白經UHT處理后具有較低的離心沉淀率和表觀黏度，其整體粒徑約為10 μm，與WPC550粒徑最接近，具有與微粒化乳清蛋白相近的耐熱特性，這表明乳清蛋白的熱穩定性得到顯著提高。乳清蛋白經過濕熱磷酸化修飾后，其熱穩定性和溶解性有所提高的原因包括：濕熱處理會使乳清蛋白的結構部分展開，暴露出更多的磷酸化修飾位點，引入更多的磷酸基團，從而增加了乳清蛋白表面的負電荷，使蛋白分子間相互排斥，減少聚集；磷酸鹽具有螯合金屬離子的作用，可以減少蛋白在加熱過程中鹽橋的形成；磷酸化可以促進乳清蛋白之間的共價修飾與氫鍵的形成，從而增強蛋白質分子間的相互作用。以上結論表明適宜的濕熱磷酸化條件可以顯著提高乳清蛋白的耐熱特性，有助于解決高蛋白飲料在UHT加工生產中發生沉淀變性的難題。第一作者：
董暄碩士研究生
天津科技大學食品科學與工程學院
2023.09-至今：天津科技大學碩士研究生在讀，2024.03-至今：中國農業科學院農產品加工研究所進行聯合培養，完成課題研究。碩士期間研究方向為乳品加工與品質調控。
引文格式：
董暄, 路茹青, 逄曉陽, 等. 濕熱磷酸化提升乳清蛋白熱穩定性的作用與機制[J]. 食品科學, 2025, 46(24): 106-114. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250530-209.
DONG Xuan, LU Ruqing, PANG Xiaoyang, et al. Effect and mechanism of moist-heat phosphorylation on improving the thermal stability of whey protein[J]. Food Science, 2025, 46(24): 106-114. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250530-209.
實習編輯：俞逸嵐；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網
為匯聚全球智慧共探產業變革方向，搭建跨學科、跨國界的協同創新平臺，由北京食品科學研究院、中國肉類食品綜合研究中心、國家市場監督管理總局技術創新中心（動物替代蛋白）、中國食品雜志社《食品科學》雜志（EI收錄）、中國食品雜志社《Food Science and Human Wellness》雜志（SCI收錄）、中國食品雜志社《Journal of Future Foods》雜志（ESCI收錄）主辦，西南大學、 重慶市農業科學院、 重慶市農產品加工業技術創新聯盟、重慶工商大學、重慶三峽學院、西華大學、成都大學、四川旅游學院、西昌學院、北京聯合大學協辦的“ 第三屆大食物觀·未來食品科技創新國際研討會 ”， 將于2026年4月25-26日 （4月24日全天報到） 在中國 重慶召開。
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為系統提升我國食品營養與安全的科技創新策源能力，加速科技成果向現實生產力轉化，推動食品產業向綠色化、智能化、高端化轉型升級，由北京食品科學研究院、中國食品雜志社《食品科學》雜志（EI收錄）、中國食品雜志社《Food Science and Human Wellness》雜志（SCI收錄）、中國食品雜志社《Journal of Future Foods》雜志（ESCI收錄）主辦，合肥工業大學、安徽農業大學、安徽省食品行業協會、安徽大學、合肥大學、合肥師范學院、北京工商大學、中國科技大學附屬第一醫院臨床營養科、安徽糧食工程職業學院、安徽省農科院農產品加工研究所、安徽科技學院、皖西學院、黃山學院、滁州學院、蚌埠學院共同主辦的“第六屆食品科學與人類健康國際研討會”，將于 2026年8月15-16日（8月14日全天報到）在中國 安徽 合肥召開。
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