浙江大學(xué)李承喜&張治國(guó)JACS：PMDA四功能連接子實(shí)現(xiàn)賴(lài)氨酸選擇性環(huán)化與自動(dòng)化大環(huán)組裝

導(dǎo)讀

環(huán)肽因兼具較高構(gòu)象穩(wěn)定性、良好靶標(biāo)識(shí)別能力和可調(diào)控的功能展示方式，已成為化學(xué)生物學(xué)和藥物發(fā)現(xiàn)中的重要分子骨架。肽鏈“釘合”（peptide stapling）能夠通過(guò)共價(jià)連接兩個(gè)特定位點(diǎn)來(lái)限制肽鏈構(gòu)象，從而提高抗蛋白酶降解能力和生物功能。然而，現(xiàn)有釘合策略往往依賴(lài)非天然氨基酸或半胱氨酸等特定反應(yīng)位點(diǎn)，在底物適用性、化學(xué)選擇性、后期功能化能力和自動(dòng)化兼容性之間仍難以兼顧。

PMDA連接子驅(qū)動(dòng)賴(lài)氨酸選擇性環(huán)化、后期功能化與自動(dòng)化大環(huán)組裝

針對(duì)這一瓶頸，浙江大學(xué)李承喜教授和張治國(guó)教授報(bào)道了一種基于商業(yè)化小分子焦均苯四甲酸二酐（pyromellitic dianhydride, PMDA）的賴(lài)氨酸–賴(lài)氨酸選擇性環(huán)化新策略。該方法利用PMDA的四功能反應(yīng)特征，在溫和條件下實(shí)現(xiàn)未保護(hù)肽中賴(lài)氨酸ε-氨基的高選擇性分子內(nèi)雙酰胺化，同時(shí)保留兩個(gè)羧酸手柄用于后續(xù)功能化。相關(guān)成果以“A Modular PMDA Linker Enables Lysine-Selective Cyclization of Unprotected Peptides and Automated Macrocycle Assembly”為題發(fā)表于Journal of the American Chemical Society。

PMDA連接子：一次反應(yīng)，同時(shí)完成環(huán)化與功能手柄安裝

PMDA通常用于聚酰亞胺等材料化學(xué)中，其酸酐結(jié)構(gòu)可被胺類(lèi)親核試劑開(kāi)環(huán)。作者注意到，含有兩個(gè)賴(lài)氨酸的肽序列具有柔性ε-氨基和一定的分子內(nèi)預(yù)組織效應(yīng)，可能誘導(dǎo)PMDA優(yōu)先發(fā)生分子內(nèi)雙酰胺化，而不是無(wú)序的分子間聚合或多位點(diǎn)修飾。基于這一設(shè)想，團(tuán)隊(duì)將PMDA重新定義為一種面向肽大環(huán)構(gòu)建的四功能連接子：其中兩個(gè)酸酐羰基與兩個(gè)賴(lài)氨酸ε-氨基形成酰胺鍵，實(shí)現(xiàn)Lys–Lys stapling；另外兩個(gè)開(kāi)環(huán)后形成的羧酸則作為后續(xù)偶聯(lián)和結(jié)構(gòu)拓展的功能手柄。

因此，PMDA并不是一個(gè)簡(jiǎn)單的交聯(lián)試劑，而是在一次反應(yīng)中同時(shí)完成“環(huán)化”和“功能手柄安裝”，從而為單環(huán)肽、雙環(huán)肽以及多功能偶聯(lián)物的構(gòu)建提供了統(tǒng)一平臺(tái)。

圖1｜研究策略示意圖。與已有Lys–Lys stapling策略相比，本工作使用PMDA作為四功能連接子，既實(shí)現(xiàn)賴(lài)氨酸選擇性環(huán)化，又保留兩個(gè)羧酸手柄用于后續(xù)功能化，并與固相/自動(dòng)化合成兼容

溫和而高選擇性的非保護(hù)肽賴(lài)氨酸環(huán)化

作者首先以Ac-KFPFK-NH2作為模型底物，對(duì)堿、溶劑、溫度和當(dāng)量進(jìn)行系統(tǒng)篩選。結(jié)果顯示，在HFIP/MeCN體系中，以TMG為堿可以顯著促進(jìn)分子內(nèi)雙酰胺化，并抑制單修飾和二聚副產(chǎn)物的生成。優(yōu)化后，模型肽環(huán)化可獲得很高的LC估算收率。更重要的是，該反應(yīng)表現(xiàn)出優(yōu)異的氨基酸兼容性。

作者設(shè)計(jì)了覆蓋Asp、Glu、Ser、Thr、Tyr、His、Trp、Met、Arg、Cys等多種潛在反應(yīng)性側(cè)鏈的未保護(hù)肽，LC-MS結(jié)果表明這些非賴(lài)氨酸殘基均未發(fā)生可檢測(cè)的PMDA衍生修飾，說(shuō)明該體系對(duì)賴(lài)氨酸ε-氨基具有高度選擇性。

圖2｜PMDA介導(dǎo)Lys–Lys stapling的條件優(yōu)化與化學(xué)選擇性驗(yàn)證。TMG/HFIP–MeCN體系可高效促進(jìn)模型肽分子內(nèi)環(huán)化，并在多種活潑側(cè)鏈存在時(shí)仍保持對(duì)賴(lài)氨酸ε-氨基的優(yōu)異選擇性

從底物拓展到雙環(huán)化與后期偶聯(lián)

在底物范圍方面，作者系統(tǒng)考察了i+0到i+7不同間隔的賴(lài)氨酸位點(diǎn)，均可順利發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化，說(shuō)明該策略對(duì)環(huán)尺寸和間隔長(zhǎng)度具有較強(qiáng)適應(yīng)性。進(jìn)一步地，在多種具有潛在抗菌活性的肽序列中，該反應(yīng)同樣能夠穩(wěn)定運(yùn)行，表現(xiàn)出良好的序列適應(yīng)性和官能團(tuán)耐受性。

圖3｜底物范圍研究。無(wú)論是不同Lys間隔的底物，還是包含復(fù)雜側(cè)鏈的肽序列，均可高效發(fā)生PMDA介導(dǎo)的大環(huán)化

PMDA環(huán)化產(chǎn)物中保留的兩個(gè)羧酸手柄進(jìn)一步打開(kāi)了高階結(jié)構(gòu)構(gòu)建空間。團(tuán)隊(duì)通過(guò)羧酸活化與第二段肽鏈接入，構(gòu)建了一系列雙環(huán)肽；同時(shí)還實(shí)現(xiàn)了與PNA、小分子藥物氨氯地平以及生物素標(biāo)簽的雙位點(diǎn)偶聯(lián)，甚至獲得同時(shí)含有氨氯地平和生物素的異雙功能化產(chǎn)物。

圖4｜PMDA環(huán)化產(chǎn)物的應(yīng)用拓展。保留的雙羧酸手柄可用于模塊化構(gòu)建雙環(huán)肽，并可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)PNA偶聯(lián)、藥物偶聯(lián)和生物素標(biāo)記等后期功能化

提升功能肽穩(wěn)定性，并無(wú)縫接入自動(dòng)化平臺(tái)

為驗(yàn)證該策略在功能肽中的應(yīng)用潛力，作者選擇黃蜂毒素來(lái)源的抗菌肽anoplin作為模型。PMDA單環(huán)化和雙環(huán)化顯著提高了肽的蛋白酶穩(wěn)定性；CD光譜顯示，PMDA環(huán)化能夠增強(qiáng)肽鏈構(gòu)象約束；抗菌測(cè)試也表明，PMDA釘合后的肽對(duì)MRSA的活性?xún)?yōu)于相應(yīng)線性肽。

圖5｜PMDA釘合對(duì)功能肽性質(zhì)的影響。以anoplin為模型，單環(huán)/雙環(huán)化顯著提升蛋白酶穩(wěn)定性，并在MRSA測(cè)試中保持甚至改善抗菌活性

該化學(xué)策略還被成功移植到固相合成和自動(dòng)化合成平臺(tái)中。通過(guò)Alloc選擇性脫保護(hù)后，PMDA可在樹(shù)脂上實(shí)現(xiàn)賴(lài)氨酸側(cè)鏈間環(huán)化。進(jìn)一步地，團(tuán)隊(duì)將氨基酸組裝、保護(hù)基操作和PMDA環(huán)化整合到CycloBot自動(dòng)化平臺(tái)中，在無(wú)需硬件改造的情況下實(shí)現(xiàn)端到端自動(dòng)化大環(huán)組裝。與手動(dòng)固相流程相比，自動(dòng)化流程顯著縮短操作時(shí)間，并提高了目標(biāo)環(huán)肽的合成效率。

圖6｜PMDA介導(dǎo)環(huán)化與自動(dòng)化合成兼容。作者在CycloBot平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)了從肽鏈組裝、脫保護(hù)到PMDA環(huán)化的一體化自動(dòng)流程，顯著提升了宏環(huán)組裝效率

總結(jié)與展望

這項(xiàng)工作將一個(gè)商業(yè)化、廉價(jià)易得的材料化學(xué)單體PMDA轉(zhuǎn)化為面向環(huán)肽藥物發(fā)現(xiàn)的四功能連接子，實(shí)現(xiàn)了未保護(hù)肽中賴(lài)氨酸選擇性環(huán)化、雙羧酸手柄安裝、雙環(huán)肽構(gòu)建、多功能偶聯(lián)以及自動(dòng)化合成的集成。該策略為環(huán)肽分子的快速制備、后期修飾和自動(dòng)化篩選提供了新的通用工具，也進(jìn)一步拓展了可編程肽合成平臺(tái)的化學(xué)能力。

論文第一作者為浙江大學(xué)吳嘉樹(shù)、詹汪琳和楊星星，通訊作者為浙江大學(xué)李承喜教授和張治國(guó)教授。研究得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金創(chuàng)新研究群體、國(guó)家自然科學(xué)基金、博士后創(chuàng)新人才支持計(jì)劃和中國(guó)博士后科學(xué)基金等項(xiàng)目支持。

論文信息

論文標(biāo)題：A Modular PMDA Linker Enables Lysine-Selective Cyclization of Unprotected Peptides and Automated Macrocycle Assembly

論文作者：Jiashu Wu?, Wanglin Zhan?, Xingxing Yang?, Chengxi Li*, Qiwei Yang, Zongbi Bao, Qilong Ren, Zhiguo Zhang*

原文鏈接：https://doi.org/10.1021/jacs.6c09909