Phytomedicine: 廣州中醫藥大學等揭示中藥淫羊藿來源外囊泡,激活VEGF介導的血管生成緩解絕經后骨質疏松癥

今天分享一篇在著名期刊Phytomedicine上,廣州中醫藥大學第三附屬醫院中醫藥防治骨質疏松癥研究廣州重點實驗室\廣州中醫藥大學廣東中草藥囊泡工程研究中心等團隊發表“Epimedium brevicornu Maxim.-derived extracellular vesicle-like particles stimulate VEGF-mediated angiogenesis to alleviate postmenopausal osteoporosis”的研究論文。

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絕經后骨質疏松癥（PMOP）是一種可引發脆性骨折的骨骼疾病，影響全球數百萬絕經后女性。淫羊藿（EpimediumbrevicornuMaxim.，EP）具有抗骨質疏松潛力，但其活性成分與作用機制尚不明確。淫羊藿源胞外囊泡樣顆粒（EPEVLPs）是天然存在的生物活性組分，目前尚無研究全面闡明EPEVLPs在PMOP中的雙重調控作用。目的：探究EPEVLPs對絕經后骨質疏松癥的骨靶向能力與治療效果。方法：采用差速超速離心法從新鮮淫羊藿葉片中分離EPEVLPs，并通過透射電鏡、納米顆粒跟蹤分析、SDSPAGE、瓊脂糖凝膠電泳、薄層色譜、高效液相色譜進行系統表征。在絕經后骨質疏松模型體內評估骨靶向特異性、抗骨質疏松活性與生物相容性。體外實驗包括：（1）通過免疫組化染色與RTqPCR評估人骨髓間充質干細胞（hBMSCs）與MC3T3細胞的成骨分化；（2）通過CCK8與流式細胞術檢測人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）增殖與凋亡；（3）通過生物信息學分析、劃痕愈合、Transwell遷移、管形成實驗與ELISA評估血管生成潛能。結果：從淫羊藿中分離得到杯狀雙層納米結構的EPEVLPs，包含核酸、蛋白質、脂質、淫羊藿次苷C及關鍵抗骨質疏松化合物（淫羊藿苷）。體內實驗顯示其優先富集于骨質疏松股骨，有效減輕骨丟失且無肝腎毒性。機制上，EPEVLPs以劑量依賴性方式上調血管內皮生長因子（VEGF）表達，增強HUVECs增殖、遷移與管形成。這種由血管生成驅動的骨血管微環境重塑與骨穩態恢復相關。結論：本研究證實EPEVLPs通過淫羊藿苷介導激活VEGF依賴性血管生成，從而改善絕經后骨質疏松癥。該植物源納米平臺通過血管再生偶聯成骨作用恢復骨穩態，為靶向治療提供了具有轉化前景的新策略。

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絕經后骨質疏松癥（PMOP）是一種以絕經后雌激素急劇下降導致骨量減少為特征的全身性骨骼疾病。隨著女性年齡增長，骨丟失呈漸進性、隱匿性發生，導致骨密度與骨強度下降、脆性增加、骨折風險升高，進而降低預期壽命。目前骨質疏松的藥物治療包括雙膦酸鹽、雷洛昔芬、降鈣素、雌激素、地諾單抗與合成代謝藥物（ArceoMendoza&Camacho，2021）。然而，頜骨壞死、骨轉換抑制引發的非典型股骨骨折、心房顫動等不良反應限制了這些藥物的長期使用。此外，雌激素替代治療會升高靜脈血栓栓塞等不良事件風險。綜上，亟需開發天然、安全的骨質疏松干預手段。

植物源胞外囊泡樣顆粒（PEVLPs）是從天然植物中分離的囊泡樣納米顆粒，因其來源豐富、免疫原性低、活性顯著等優勢受到廣泛關注。PEVLPs天然富含蛋白質、脂質、RNA等生物活性分子，其優異的生物相容性、組織穿透性與理化穩定性使其可作為生物治療劑與藥物遞送系統。此外，PEVLPs可實現精準遞送，改善活性成分生物利用度不足的問題并提升生物安全性。研究表明，人參源胞外囊泡樣顆粒（GEVLPs）可與切除的自體腫瘤細胞膜雜交形成功能化雜交囊泡（HMNPs）并用作疫苗，通過HMNPs免疫可降低術后腫瘤復發與轉移風險，同時保持良好生物相容性。本團隊前期兩項研究發現，骨碎補（RD）與巴戟天（MO）源胞外囊泡樣顆粒均表現出良好的骨組織靶向活性與抗骨質疏松作用，可逆轉骨質疏松。此外，山藥源EVLPs經小鼠口服給藥可促進骨再生且具有良好的全身生物安全性。

淫羊藿（EpimediumbrevicornuMaxim.，EP），俗稱仙靈脾，為小檗科多年生草本植物，其干燥地上部分入藥。作為中醫藥數千年來的核心藥材，淫羊藿因“補腎益精、強筋健骨”的傳統功效被廣泛用于PMOP治療。現代藥理研究已鑒定其生物活性成分，包括主要黃酮類成分淫羊藿苷、黃酮、木脂素、生物堿與揮發油。值得注意的是，新興研究聚焦于闡明淫羊藿抗骨質疏松活性的分子機制，尤其是淫羊藿苷及相關化合物介導的破骨細胞抑制與成骨細胞激活。

本研究從新鮮淫羊藿葉片中分離純化高產量的淫羊藿源胞外囊泡樣顆粒（EPEVLPs），并從生物活性成分新角度探究其作用機制，闡明淫羊藿的抗骨質疏松效應。

1.EPEVLPs的理化表征

EPEVLPs呈現典型的杯狀雙層膜結構形態特征（圖1A），粒徑分布在50–150nm之間（圖1B）。如圖1C所示，EPEVLPs對TritonX100濃度升高呈濃度依賴性響應，當TritonX100濃度升至0.1%時，顆粒濃度低于10%，表明EPEVLPs純度高于90%。EPEVLPs主要包含小分子量RNA、小分子量蛋白（10–35kDa）與多種脂質（圖1D–F），提示其可能通過RNA、蛋白與脂質組分參與細胞間通訊并介導生物學過程。樣品色譜圖中出現兩個特征峰（圖1G），與淫羊藿次苷C（圖1H）、淫羊藿苷（圖1I）標準品比對后，確認這兩個特征峰分別對應淫羊藿次苷C與淫羊藿苷。此外，通過納米顆粒跟蹤分析（NTA）對EPEVLPs進行表征（主峰154nm），并通過小RNA測序鑒定出146個miRNA。代謝組學分析進一步揭示了多類代謝物（補充圖S5）。

2.EPEVLPs的體內分布與生物安全性

如圖2A–B所示，游離DiR染料與DiR標記的EPEVLPs均逐漸在肝、脾、肺組織富集。靜脈給藥后，DiR與EPEVLPs在12h于肝、脾、肺中富集量最高，24h與48h逐漸下降；而灌胃給藥后，其在肝、脾、肺中的熒光強度隨時間無明顯變化。值得注意的是，兩種給藥途徑下，股骨處熒光強度均隨時間升高，提示EPEVLPs可進入體循環（即使口服給藥）并在股骨部位富集。如圖2C–F所示，EPEVLPs組與對照組血清ALT、AST、BUN、Crea水平無顯著差異（p>0.05）。HE染色顯示，對照組與EPEVLPs組主要臟器（心、肝、脾、肺、腎）均無病理性損傷（圖2G），表明EPEVLPs具有良好的生物安全性。

3.EPEVLPs改善去卵巢小鼠骨質疏松

與假手術組相比，OVX組小鼠右側股骨顯微CT分析顯示股骨遠端骨小梁結構顯著破壞（圖3A），提示EPEVLPs對PMOP具有治療潛力。定量分析顯示（圖3B），OVX組BMD、BV、BV/TV（%）、Tb.N顯著低于假手術組（p<0.01），而SMI、Tb.Sp顯著高于假手術組（p<0.01），證實OVX模型構建成功。值得注意的是，高劑量EPEVLPs顯著逆轉去卵巢誘導的骨小梁結構紊亂（圖3A）；與未處理OVX對照組相比，EPEVLPs給藥顯著減輕骨丟失，表現為BMD、BV、BV/TV、Tb.N升高（p<0.05），SMI、Tb.Sp降低（p<0.05）。低劑量EPEVLPs對絕經后小鼠骨質疏松療效有限，僅使BMD小幅提升（6.74%，p<0.05），BV、BV/TV、Tb.N、Tb.Sp、SMI等關鍵微觀結構指標無顯著改善（與OVX組相比均p>0.05），因此后續組織學分析（圖3C–F）僅聚焦高劑量組，探究骨再生的潛在機制。免疫組化分析顯示，與OVX組相比，EPEVLPs處理顯著升高骨組織中ALP與OCN表達（p<0.05；圖3C–F）。

4.EPEVLPs體外不直接促進成骨

補充圖S1A–B顯示，當濃度不高于1×101?particles/mL時無細胞毒性，且EPEVLPs既不促進也不抑制hBMSCs與MC3T3E1細胞增殖。茜素紅染色顯示，EPEVLPs處理未增加hBMSCs或MC3T3E1細胞的鈣沉積（補充圖S1C）。RUNX2、OCN、BMP2是成骨分化過程中的關鍵成骨細胞標志物，基因表達分析顯示，EPEVLPs處理后hBMSCs與MC3T3E1細胞中RUNX2、OCN、BMP2基因水平穩定（補充圖S1D–I）。以上結果提示EPEVLPs不直接促進成骨細胞增殖與分化，其抗骨質疏松作用可能通過其他途徑介導。

5.EPEVLPs的代謝組學與網絡藥理學關聯分析

為探究EPEVLPs治療骨質疏松的作用機制，本研究結合代謝組學與網絡藥理學構建藥物成分
疾病靶點整合網絡，隨后通過分子對接、分子動力學模擬、表面等離子體共振（SPR）評估藥物成分與靶點蛋白的結合親和力與穩定性。在EPEVLPs與淫羊藿中共同鑒定出11種活性成分：淫羊藿次苷C、淫羊藿苷、箭藿苷A、淫羊藿苷A、淫羊藿定C、淫羊藿定B、胡薄荷酮、甲基丁香酚、酪醇、仙靈藿苷D、己糖苷E（圖4A）。代謝組學數據顯示，箭藿苷A、淫羊藿苷、淫羊藿定B、淫羊藿次苷C是EPEVLPs中11種共有成分中含量最高的四種（圖4B）。此外，淫羊藿苷與淫羊藿次苷C的101個靶點基因與骨質疏松相關（圖4C）。KEGG通路富集分析顯示，這些靶點基因顯著富集于VEGF信號通路（圖4D）。網絡分析表明，EPEVLPs與淫羊藿中的多數共有成分與骨質疏松核心信號靶點相關（圖4E）。PPI網絡分析進一步確定VEGFR（VEGF受體）是骨質疏松相關信號通路中的關鍵蛋白（圖4F）。分子對接顯示，仙靈藿苷D、淫羊藿定B、箭藿苷A、淫羊藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿苷A的結合活性優于其他EPEVLPs成分（結合能<?8.2kcal/mol）（圖4G，補充圖S2）。淫羊藿苷作為淫羊藿的主要黃酮活性成分，在EPEVLPs代謝組學分析中平均表達量位居第二，且廣泛用于骨相關疾病治療（Si等，2024；Zhang等，2022），同時被《中國藥典》列為質量控制標準，因此選擇淫羊藿苷作為目標生物活性分子開展研究。分子動力學模擬顯示淫羊藿苷與VEGFR2結合穩定，提示其潛在生物活性（補充圖S3）。SPR證實淫羊藿苷與VEGFR2受體特異性結合（KD=2.47e?4M），驗證其對VEGF通路的靶向作用（圖4H）。

6.EPEVLPs對HUVECs的細胞毒性及體外/體內內化

凋亡與CCK8實驗評估細胞毒性顯示，EPEVLPs在濃度低于1×1012particles/mL時對HUVECs無顯著凋亡誘導作用，生物安全性優異（圖5A）。CCK8實驗顯示，EPEVLPs對HUVECs具有劑量依賴性增殖作用，但濃度達1×1012particles/mL時細胞活力顯著下降（圖5B）。

為驗證細胞攝取，將DiI標記的EPEVLPs與HUVECs共孵育8h，流式細胞術顯示各濃度組內化率均>90%（圖5C）。熒光顯微鏡觀察（圖5D–E）顯示，DiI標記的EPEVLPs（紅色）隨時間在細胞質中累積，4h后出現大量內化，提示起效迅速。

同時探究EPEVLPs對體內血管內皮細胞的影響，DiI標記EPEVLPs組小鼠肝、腎、腹主動脈、股骨組織均出現較強熒光信號（補充圖S4A）；腹主動脈組織切片共聚焦圖像中觀察到EPEVLPs（紅色）與血管內皮細胞（綠色）共定位（白色箭頭）（圖5F–G）。

7.EPEVLPs對血管生成的影響

為探究EPEVLPs對HUVECs遷移的影響，開展劃痕愈合與Transwell遷移實驗。如圖6A–B所示，EPEVLPs處理的內皮細胞劃痕愈合增強，24h愈合率約30%–50%，顯著高于正常對照組（p<0.01）。Transwell實驗證實EPEVLPs顯著促進HUVECs遷移（補充圖S4B）。內皮細胞黏附、融合與管狀結構形成是血管生成的關鍵環節，因此基于Matrigel的管形成實驗顯示，與對照組相比，EPEVLPs在3、6、12h顯著加速HUVECs管狀網絡形成（圖6C）；累積管長定量分析顯示，各時間點EPEVLPs組管長均顯著更長（圖6D）。以上結果表明，EPEVLPs通過增強內皮細胞遷移與管形成促進早期血管生成。

CD31是評估血管生成的血管內皮標志物，通過免疫組化評估EPEVLPs對OVX小鼠股骨CD31表達的影響。EPEVLPs組CD31表達顯著高于OVX組，OVX組顯著低于假手術組（p<0.05，圖6E–F）。綜上，EPEVLPs可直接促進血管化，并通過增強血管生成發揮抗骨質疏松作用。

8.EPEVLPs通過VEGF信號通路促進血管生成

PCR與ELISA結果分析（圖7A–B）顯示，EPEVLPs顯著上調HUVECs中VEGF的mRNA與蛋白水平。關鍵的是，加入臨床獲批的VEGF通路抑制劑貝伐珠單抗可有效抑制EPEVLPs誘導的VEGF上調，該抑制效應在蛋白水平較轉錄水平更顯著（ELISA平均抑制率86%，PCR為27.69%）。以上結果共同表明，EPEVLPs主要通過激活VEGF信號通路促進血管生成，增強的血管化有助于改善骨微環境，最終緩解骨質疏松（圖7C）。

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