大衛貝克團隊用AI構建可編程熒光標簽，利用生成式蛋白實現高精度多目標熒光成像

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如果想同時觀察一個細胞里的多個蛋白質，會遇到一個看似簡單卻始終困擾生物學家的問題。

傳統熒光成像依賴不同顏色的熒光染料對目標進行標記。然而，隨著需要同時觀察的目標越來越多，有限的熒光顏色很快就會成為瓶頸。更麻煩的是，不同熒光蛋白之間往往存在光譜重疊，不僅降低圖像質量，也限制了復雜生物過程的解析能力。

而近年來新興的思路是設計能夠專門識別這些染料的小型蛋白標簽。但對于天然蛋白而言，很難同時滿足穩定折疊、小體積、高親和力這些需求；傳統蛋白工程主要依賴天然模板不斷改造，既耗時，也很難突破天然結構本身的限制。

大衛貝克團隊于 2026 年 7 月 16 日發表了一項研究，在「De novo design of orthogonal far-red, orange, and green fluorophore-binding proteins for multiplexed imaging」中，團隊提出了NovoTag技術路線。他們結合 AI 蛋白設計、結構預測和實驗篩選，從零開始設計能夠特異性結合不同熒光染料的新型蛋白標簽，并進一步構建出一套適用于多目標熒光成像的蛋白—染料體系。

論文鏈接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.aeb0822

重新設計蛋白

過去，大多數熒光標簽的發展都建立在天然蛋白基礎之上。

研究人員通常會先找到一種能夠與特定小分子結合的天然蛋白，再通過定點突變、定向進化等方法不斷優化結合能力。這種策略已經取得了不少成功，但也存在明顯局限：天然蛋白原本承擔著各自的生物學功能，它們的結構并不是為了識別人工熒光染料而進化出來，因此能夠優化的空間始終有限。

因此，研究團隊選擇了一條完全不同的技術路線。

團隊借鑒了「偽環狀結構」的思路：讓蛋白質形成一個封閉的環狀口袋，將染料包裹其中。這種結構在天然小分子結合蛋白中常見，但從未在「配體感知」的設計語境中被系統應用。他們希望直接設計一種全新的蛋白，讓蛋白的空間結構從一開始就圍繞目標熒光染料進行構建，而不是在天然蛋白基礎上不斷修補。

圖 1：結合 Janelia 熒光染料蛋白的設計與表征。

技術上，團隊使用了 Cα RFdiffusion——一種生成式深度學習模型——直接圍繞每種染料的三維結構生成蛋白質骨架。這能讓模型從起點就知道染料的位置和形狀，在染料周圍「生長」出合適的蛋白結構。隨后用 LigandMPNN 為骨架賦予序列，并通過 Rosetta 計算結合能、AlphaFold2 驗證序列-結構一致性，從數千個候選中篩選出高置信度設計，最終在酵母表面展示和流式分選中確認活性。

這些 Janelia Fluor 染料是人工合成的羅丹明衍生物，團隊利用機器學習驅動的 de novo 蛋白設計，從零開始創造出了三種小型結合蛋白：NovoTag494、NovoTag596 和 NovoTag657，分別特異性地結合綠、橙、遠紅三種染料。

三種目標染料共享同一個羅丹明核心骨架，只是在邊緣有細微的化學修飾差異。這種結構相似性對特異性提出了極高要求——結合蛋白必須像精密模具一樣，識別出染料核心周圍每一個取代基的微小差別。

圖 2：利用 NovoTags 在活細胞和固定細胞中進行多重超分辨率熒光顯微鏡成像。

進入應用場景

對于蛋白設計而言，最大的挑戰始終存在于計算預測與生物實驗之間。一個在計算模型中看似完美的結合口袋，可能因為蛋白折疊不穩定、分子環境變化，或者細胞內部復雜條件影響，最終無法實現預期功能。

研究團隊首先針對多種不同熒光染料設計候選蛋白標簽，并通過實驗篩選其中真正能夠穩定表達、正確折疊并與目標分子結合的結構。結果顯示，部分從頭設計的蛋白能夠實現高度特異性的染料識別，同時保持較小的蛋白尺寸和良好的穩定性。

此外，通過改變蛋白結合口袋的結構，不同 NovoTag 還能分別識別不同熒光染料。每一種標簽都相當于一個獨立的「分子接口」，能夠與對應染料產生選擇性結合，同時盡量避免與其他染料發生干擾。

圖 3：基于熒光壽命的 NovoTags 多重成像顯微鏡技術。

如團隊預期那般，AlphaFold 3的預測進一步證實，三種 NovoTag 與各自靶標染料形成的復合物獲得了最高的置信度評分，它們對各自靶標染料的親和力達到納摩爾級別（Kd 分別為 19.1 nM、1.5 nM 和 2.0 nM），而對其他兩種染料的特異性超過 1000 倍。

新一代的標記方式

NovoTag 展示的并不僅僅是一種新的熒光標簽技術。它標志著蛋白質設計正在從「模仿自然」邁向「超越自然」——自然界從未進化出結合這些人工染料的蛋白，但計算工具讓我們能夠為任何小分子量身定制結合器。

當然，NovoTag 仍然面臨進一步發展的挑戰。例如，如何提高設計成功率、如何擴大可識別染料范圍、如何讓這些標簽適應更加復雜的生物環境，都是未來需要解決的問題。據研究團隊估算，若能結合先進的光譜解混技術和壽命區分，未來可能實現 30 種以上同時可分辨的探針。