上海
構建最小基因組微生物，既是探索生命核心代謝途徑、解答“維持生命所需最小基因集合”基礎命題的理想模型，也是合成生物學中打造高效工業生物制造底盤的關鍵路徑。目前主流的“自上而下”基因組縮減策略，受限于必需基因注釋不全、合成致死效應與功能冗余基因廣泛存在等問題，大片段基因組刪除往往反復失敗，只能通過逐段試錯、多輪迭代的方式緩慢推進，效率與深度均面臨長期瓶頸。
近日，山東大學微生物技術國家重點實驗室CRISPR與古菌生物學研究中心佘群新教授、馮旭研究員團隊在Advanced Science在線發表題為CREAT: A CRISPR-Based Genome Trimming Strategy for Systematic Identification of Dispensable Regions and Rapid Genome Reduction的研究論文。團隊創新性提出名為CREAT的多同源臂模板CRISPR基因組修剪策略，將CRISPR靶向基因組切割與“同源臂步移”技術創新融合，建立“必需區分類-合成式替換”的兩步式工作流，在古菌模式生物中實現20.8%的基因組縮減，并成功拓展至多種細菌，為系統性、高效構建微生物最小基因組提供了通用新工具。
為解決傳統刪除方法“試錯成本高、分區效率低”的核心痛點，研究團隊受真核生物VDJ重組產生抗體多樣性的機制啟發，開發了同源臂步移（Homology arms walking, HA walking）技術。該技術通過設計串聯排列的多同源臂作為修復模板，在CRISPR靶向切割產生DNA雙鏈斷裂后，靶向位點兩側的不同組合的同源臂與基因組發生隨機同源重組，可在單次實驗中產生覆蓋所有缺失組合的突變體庫，從而系統劃分目標區段內的非必需區、必需區與準必需區。這一方法將多輪功能驗證整合為一步化的多重分析，不僅大幅提升了分區效率，還能同步篩選出生長優勢更優的突變株，為獲得性能優良的精簡基因組菌株提供了天然便利。
隨后基于同源臂步移獲得的精確必需基因信息，研究團隊建立了完整的CREAT基因組精簡核心流程：將鑒定得到的必需/準必需基因組裝為人工合成的同源臂模塊，通過一步基因組替換，將原本分散在必需區之間的非連續非必需序列一次性精準刪除，直接獲得深度修剪的基因組突變株。系統實驗驗證表明，CREAT策略同時適用于古菌與細菌，兼容內源I型CRISPR、外源Cas9等多種編輯系統，具備良好的普適性與多輪迭代能力。
圖1. CREAT基因組精簡策略示意圖
總體而言，CREAT策略突破了傳統基因組縮減“逐段試錯、多輪迭代”的技術局限，將多輪功能驗證整合為一步化的多重分析，顯著提升了最小基因組構建的效率與系統性。該技術不僅為不同微生物底盤的最小基因組理性設計與快速構建提供了通用方案，也為合成生物學底盤細胞的工程化改造提供了全新工具。
論文由山東大學微生物技術國家重點實驗室作為第一完成單位和通訊作者單位。博士后袁冠華為論文第一作者，馮旭研究員與佘群新教授為共同通訊作者。
原文鏈接：https://doi.org/10.1002/advs.76042
制版人：十一
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