上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院團(tuán)隊(duì)《民族藥理學(xué)》揭示扶正化瘀方可通過抑制Gli1通路減輕導(dǎo)管反應(yīng)和肝纖維化

【寫在前面】：本期推薦的是由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病研究所、上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合外科研究所等研究團(tuán)隊(duì)合作近期發(fā)表于Journal of Ethnopharmacology(IF5.4）的一篇文章，揭示扶正化瘀方可能通過抑制Gli1通路減輕導(dǎo)管反應(yīng)和肝纖維化。

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

Fuzheng Huayu formula attenuates ductular reaction and liver fibrosis potentially through suppressing Gli1 pathway

民族藥理學(xué)相關(guān)性

扶正化瘀方（FZHY）臨床上用于治療肝纖維化，但其藥理機(jī)制尚不完全清楚。

目的

探討扶正化瘀方的抗纖維化作用，尤其是對膽汁淤積性肝纖維化的療效，以及其潛在的分子機(jī)制。

方法

采用Mdr2基因敲除小鼠和CCl?/2-AAF誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠評估扶正化瘀方的治療潛力，并以Gli1抑制劑GANT61作為陽性對照藥物。通過組織學(xué)分析和雙免疫熒光技術(shù)檢測扶正化瘀方對導(dǎo)管反應(yīng)和肝纖維化的影響。體外實(shí)驗(yàn)中，使用肝祖細(xì)胞系WB-F344細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)過表達(dá)Gli1的慢病毒載體，并用丁酸鈉誘導(dǎo)分化，以驗(yàn)證扶正化瘀方的作用機(jī)制。

結(jié)果

在Mdr2小鼠和CCl?/2-AAF誘導(dǎo)的大鼠模型中，扶正化瘀方能明顯改善肝纖維化，表現(xiàn)為膠原沉積減少、肝臟羥脯氨酸含量降低以及炎性細(xì)胞浸潤減輕。扶正化瘀方降低了Epcam、CK19和CK7的表達(dá)。雙免疫熒光顯示，CCl?/2-AAF大鼠中CK19?和OV6?細(xì)胞數(shù)量增多，而扶正化瘀方治療后減少。機(jī)制上，扶正化瘀方下調(diào)了肝臟中Gli1的表達(dá)。值得注意的是，在CCl?/2-AAF誘導(dǎo)的大鼠中，扶正化瘀方對導(dǎo)管反應(yīng)和肝纖維化的抑制作用與Gli1抑制劑GANT61相似。體外實(shí)驗(yàn)中，扶正化瘀方對WB-F344細(xì)胞向膽管表型分化的抑制作用也與GANT61相似。此外，過表達(dá)Gli1的慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證實(shí)，扶正化瘀方以Gli1依賴性方式抑制WB-F344細(xì)胞向?qū)Ч鼙硇头只?/p>

結(jié)論
扶正化瘀方具有顯著的抗纖維化作用，其機(jī)制可能通過抑制Gli1通路，從而抑制肝祖細(xì)胞向?qū)Ч鼙硇头只＿@一發(fā)現(xiàn)為扶正化瘀方的作用機(jī)制提供了新的見解，并提示Gli1信號通路可能在其抗纖維化作用中發(fā)揮重要作用。

圖文摘要

【前言】

肝纖維化是一種以細(xì)胞外基質(zhì)過度積聚和纖維瘢痕形成為特征的進(jìn)行性病理狀態(tài)，常繼發(fā)于病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病和自身免疫性肝炎等慢性肝病，構(gòu)成重大的全球性健康挑戰(zhàn)。若不及時(shí)干預(yù)，肝纖維化最終會(huì)進(jìn)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌。肝纖維化的程度與多種肝臟疾病的死亡率直接相關(guān)。流行病學(xué)證據(jù)表明，肝硬化占全球年死亡率的2.4%，其中中國占全球肝硬化相關(guān)死亡病例的14.9%。由于如此沉重的疾病負(fù)擔(dān)，肝纖維化的臨床治療仍然是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。值得注意的是，臨床前研究和動(dòng)物模型已經(jīng)證實(shí)，纖維化病變具有潛在的可逆性，即使在早期肝硬化階段也是如此。這些發(fā)現(xiàn)為制定針對性的治療策略奠定了堅(jiān)實(shí)的科學(xué)基礎(chǔ)。然而，盡管研究力度很大，迄今尚無抗纖維化藥物獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）的批準(zhǔn)，這凸顯了有效治療干預(yù)措施的迫切需求。

導(dǎo)管反應(yīng)是一種見于多種肝臟疾病的組織學(xué)特征，表現(xiàn)為反應(yīng)性導(dǎo)管細(xì)胞的增生，同時(shí)伴有炎性細(xì)胞浸潤、匯管區(qū)水腫和纖維化。由于損傷刺激的多樣性，導(dǎo)管反應(yīng)中導(dǎo)管細(xì)胞的來源可以是肝祖細(xì)胞（HPC）、膽管細(xì)胞或肝細(xì)胞。在我們既往的工作中，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性膽汁性膽管炎（PBC）、乙型肝炎病毒（HBV）感染和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者中CK19?導(dǎo)管細(xì)胞的積聚與膠原面積和α-SMA面積均呈正相關(guān)。同時(shí)，我們的研究證明，來源于HPC的導(dǎo)管反應(yīng)在多種嚙齒動(dòng)物模型中顯著促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展，包括四氯化碳（CCl?）聯(lián)合2-乙酰氨基芴（2-AAF）誘導(dǎo)的大鼠、膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠、多藥耐藥基因2敲除小鼠（Mdr2?/?小鼠）以及CCl?聯(lián)合西方飲食誘導(dǎo)的小鼠。導(dǎo)管反應(yīng)細(xì)胞傾向于分泌一系列促炎和促纖維化細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGFβ1）、TGFβ2、白細(xì)胞介素-6、血小板源性生長因子和趨化因子2。這些細(xì)胞因子的分泌促進(jìn)匯管區(qū)成纖維細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞（HSC）的活化，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的積聚，從而啟動(dòng)或促進(jìn)肝纖維化過程。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源物（Gli）家族是最早發(fā)現(xiàn)與人類疾病相關(guān)的發(fā)育調(diào)控基因之一，是經(jīng)典和非經(jīng)典Hedgehog（Hh）信號通路的末端效應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，包括Gli1、Gli2和Gli3。其中，Gli1具有五個(gè)保守的鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，使其能夠與其靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域相互作用。Gli1的異常激活與細(xì)胞增殖和分化過程的失調(diào)密切相關(guān)。值得注意的是，這種異常激活與器官纖維化的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)。我們前期的研究證實(shí)，在肝纖維化進(jìn)展過程中，Gli1在促進(jìn)來源于HPC的導(dǎo)管反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在刺激多能干細(xì)胞分化為導(dǎo)管表型的模型中，已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞角蛋白19（CK19）和CK7的啟動(dòng)子區(qū)域包含Gli1的特異性結(jié)合序列，表明它們是Gli1促進(jìn)導(dǎo)管細(xì)胞增殖的直接靶點(diǎn)。基于這些發(fā)現(xiàn)，阻斷HPC來源的導(dǎo)管反應(yīng)中Gli1的激活，成為極具前景的抗肝纖維化治療方向。

中醫(yī)藥在中國治療肝纖維化有著悠久的歷史。根據(jù)中醫(yī)理論，肝纖維化的病機(jī)常以“正氣虧虛、瘀血內(nèi)阻”為特征。因此，治療原則強(qiáng)調(diào)扶助正氣、活血化瘀，這一策略與扶正化瘀方（FZHY）的組方思路高度一致。扶正化瘀方由丹參（8克）、蟲草（4克）、桃仁（2克）、絞股藍(lán)（6克）、五味子（2克）和松花粉（2克）組成。由于該方在肝纖維化和肝硬化患者中具有顯著的臨床療效，已獲得中國國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號：Z20050546）。此外，其療效已在美國FDA針對慢性丙型肝炎患者的Ⅱ期臨床試驗(yàn)中得到進(jìn)一步驗(yàn)證。然而，扶正化瘀方作用于肝祖細(xì)胞的具體機(jī)制尚不清楚，急需闡明。

本研究旨在兩種體內(nèi)模型（CCl?聯(lián)合2-AAF誘導(dǎo)的大鼠和Mdr2?/?小鼠）以及丁酸鈉（SB）誘導(dǎo)HPC分化的體外模型中，探討扶正化瘀方的藥理作用。我們的研究結(jié)果有力地證明，扶正化瘀方可能通過抑制Gli1通路，從而抑制HPC向?qū)Ч鼙硇头只M(jìn)而減輕肝纖維化。

【結(jié)果部分】

1. 扶正化瘀方改善Mdr2?/?小鼠的膽汁淤積性肝纖維化。

圖 2. 扶正化瘀方改善 Mdr2?/? 小鼠的膽汁淤積性肝纖維化。A. 肝臟連續(xù)切片代表性圖像：H&E 染色（200×）、天狼星紅染色（100×）、α-SMA 和 F4/80 免疫組織化學(xué)染色（200×）。B. 血清 ALT 含量（n = 6）。C. 血清 AST 含量（n = 6）。D. 天狼星紅陽性面積百分比形態(tài)計(jì)量學(xué)分析（n = 6）。E. 羥脯氨酸含量（n = 6）。F. Acta2 和 Col-I 的 mRNA 表達(dá)（n = 6）。G. α-SMA 的蛋白免疫印跡及灰度值分析（n = 3）。與野生型對照組相比，?P < 0.05，??P < 0.01；與 Mdr2?/? 組相比， < 0.05，# < 0.01。WT：野生型組；Mdr2?/?：Mdr2 基因敲除組；FZHY：扶正化瘀方治療組；OCA：奧貝膽酸治療組

2. 扶正化瘀方減輕CCl?聯(lián)合2-AAF誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化。

圖 3. 扶正化瘀方減輕 CCl? 聯(lián)合 2-AAF 誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化。A. 肝臟連續(xù)切片代表性圖像：H&E 染色（200×）、天狼星紅染色（100×）、以及 Col-Ⅰ 和 α-SMA 免疫組織化學(xué)染色（200×）。B. 血清 ALT 含量（n = 5）。C. 血清 AST 含量（n = 5）。D. 天狼星紅陽性面積百分比形態(tài)計(jì)量學(xué)分析（n = 5）。E ～ G. Acta2、Col-I、Col-III 和 Col-IV 的相對 mRNA 表達(dá)量（n = 5）。H. α-SMA 的蛋白免疫印跡及灰度值分析（n = 3）。與對照組相比，?P < 0.05，??P < 0.01；與 CCl?/2-AAF 組相比， < 0.05，##P < 0.01。Oil：對照組；CCl?/2-AAF：四氯化碳聯(lián)合 2-乙酰氨基芴處理組；FZHY：扶正化瘀方治療組；GANT61：GANT61 治療組。

3. 扶正化瘀方抑制纖維化環(huán)境中的導(dǎo)管反應(yīng)。

圖 4. 扶正化瘀方抑制 Mdr2?/? 小鼠中的導(dǎo)管反應(yīng)。A. Epcam、CK7 和 CK19 免疫組織化學(xué)染色代表性圖像（200×）。B. Krt19、Epcam 和 Krt7 的相對 mRNA 表達(dá)量（n = 6）。C. CK19 的蛋白免疫印跡及灰度值分析（n = 3）。與野生型對照組相比，?P < 0.05，??P < 0.01；與 Mdr2?/? 組相比， < 0.05，# < 0.01。WT：野生型組；Mdr2?/?：Mdr2 基因敲除組；FZHY：扶正化瘀方治療組；OCA：奧貝膽酸治療組。

圖 5. 扶正化瘀方抑制 CCl?/2-AAF 誘導(dǎo)的大鼠中的導(dǎo)管反應(yīng)。A. OV6、Epcam、CK19 和 CK7 免疫組織化學(xué)染色代表性圖像（200×）。B. CK19（紅色）與 OV6（綠色）共染色的共聚焦分析（200×）。C. Krt19、Epcam 和 Krt7 的相對 mRNA 表達(dá)量（n = 5）。D. CK19 的蛋白免疫印跡及灰度值分析（n = 3）。與對照組相比，?P < 0.05，??P < 0.01；與 CCl?/2-AAF 組相比， < 0.05，# < 0.01。Oil：對照組；CCl?/2-AAF：四氯化碳聯(lián)合 2-乙酰氨基芴處理組；FZHY：扶正化瘀方治療組；GANT61：GANT61 治療組。

4. 扶正化瘀方在纖維化模型中抑制Hedgehog信號通路。

圖 6. 扶正化瘀方減輕纖維化動(dòng)物模型中 Hedgehog 通路的激活。A. Mdr2?/? 小鼠中 Dhh、Shh、Ihh、Smo、Ptch1、Ptch2、Gli1 和 Gli2 的 mRNA 表達(dá)量（n = 6）。B. Gli1 的蛋白免疫印跡及灰度值分析（n = 3）。C. CCl?/2-AAF 誘導(dǎo)的大鼠中 Dhh、Ihh、Shh、Ptch1、Ptch2、Smo、Gli1、Gli2 和 Gli3 的相對 mRNA 表達(dá)量（n = 5）。與對照組相比，?P < 0.05，??P < 0.01；與 CCl?/2-AAF 組或 Mdr2?/? 組相比， < 0.05，# < 0.01。WT：野生型組；Mdr2?/?：Mdr2 基因敲除組；FZHY：扶正化瘀方治療組；OCA：奧貝膽酸治療組。Oil：對照組；CCl?/2-AAF：四氯化碳聯(lián)合 2-乙酰氨基芴處理組；FZHY：扶正化瘀方治療組；GANT61：GANT61 治療組。

5.扶正化瘀方在體外抑制了肝祖細(xì)胞向膽管細(xì)胞的分化及扶正化瘀方以Gli1依賴的方式減輕了導(dǎo)管反應(yīng)。

圖 7. 扶正化瘀方在體外抑制肝祖細(xì)胞向膽管細(xì)胞的分化。A. 扶正化瘀方對 WB-F344 細(xì)胞的細(xì)胞活力影響。B. Krt19 和 Krt7 的 mRNA 表達(dá)量（n = 3）。C. CK19 的蛋白免疫印跡及灰度值分析（n = 3）。D. Dhh、Smo、Ptch2、Gli1 和 Gli2 的 mRNA 表達(dá)量（n = 3）。E. Krt19、Krt7 和 Gli1 的 mRNA 表達(dá)量（n = 3）。F. WB-F344 細(xì)胞經(jīng) CK19 染色的代表性熒光圖像（600×）。G. CK19 的蛋白免疫印跡及灰度值分析（n = 3）。H. Krt19 和 Gli1 的 mRNA 表達(dá)量（n = 3）。與對照組相比，?P < 0.05，??P < 0.01；與 SB 誘導(dǎo)模型組相比， < 0.05，# < 0.01；與扶正化瘀方低劑量組相比，△P < 0.05，△△P < 0.01。a：與 OE-Neg 組相比，P < 0.05；b：與 OE-Gli1 組相比，P < 0.05；c：與 SB + OE-Gli1 組相比，P < 0.05；d：與 SB + OE-Neg 組相比，P < 0.05。

【結(jié)論與討論】

總之，我們最近的研究提供了進(jìn)一步的證據(jù)，支持扶正化瘀方（FZHY）對肝纖維化（包括膽汁性纖維化）的治療效果。我們的研究首次表明，扶正化瘀方的抗纖維化機(jī)制涉及抑制肝祖細(xì)胞（HPC）向?qū)Ч鼙硇头只疫@一作用似乎與抑制Gli1信號通路相關(guān)。

注：本文原創(chuàng)表明為原創(chuàng)編譯，非聲張版權(quán)，侵刪！

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