不用等光子集齊AI算出超清圖像！清華讓熒光壽命成像告別光子焦慮

熒光顯微鏡是生命科學研究的一雙重要“眼睛”。科學家可以用熒光分子標記細胞、蛋白質，再觀察它們出現在哪里、怎樣運動以及信號如何變化。

不過，普通熒光成像主要看亮度。一個位置更亮，可能意味著目標分子更多，但也可能只是熒光探針更多、激發光更強，或者組織對光的衰減更少。因此，“變亮了”并不總能直接告訴我們分子發生了什么變化。

除了亮度之外，熒光其實還隱藏著另一個重要信息：壽命。

熒光分子吸收光子后，會短暫進入激發態，隨后返回基態并釋放光子。它在激發態平均停留的時間，就是熒光壽命（Fluorescence Lifetime）。

與亮度相比，熒光壽命不容易受到探針濃度和激發功率等因素影響，卻會隨著熒光分子構象和周圍微環境發生變化。在顯微成像中測量這一時間信息的技術，被稱為熒光壽命成像顯微術（fluorescence lifetime imaging microscopy，FLIM）。借助 FLIM，研究人員可以進一步了解離子濃度、能量代謝、分子相互作用和蛋白質構象等傳統強度成像難以直接觀察的信息，被廣泛應用于神經科學、細胞生物學、免疫學、結構生物學和病理學研究。

但這種信息更豐富的成像方式，一直受到一個現實問題的限制：太依賴光子（光的最小單位）。傳統 FLIM 要反復激發同一個像素（樣本里的同一個區域），積累大量光子的到達時間形成直方圖，再估算熒光壽命。這不僅拖慢成像速度，提高激發功率，還可能加重光漂白和光毒性。

近日，清華大學戴瓊海院士、吳嘉敏副教授團隊在 Nature Biotechnology發文。他們提出首光子事件感知熒光壽命成像方法 EFLIM（event-based first-photon FLIM），這種方法不再等待每個像素積累大量光子，而是重新利用每一次激發及首達光子的時間信息。即使平均每個像素探測到的光子低于 1 個，EFLIM 仍能恢復出穩定的熒光壽命圖像。

為什么一定要壘直方圖？

熒光壽命的定量測量可追溯至 20 世紀早期，但直到 20 世紀 90 年代，將壽命測量與顯微成像結合的熒光壽命成像技術（FLIM），才真正得以實現。時至今日，FLIM 已被集成到一些商業顯微系統中，但其使用相較強度成像仍未廣泛普及。一個關鍵瓶頸在于：熒光壽命的精確估計極度依賴海量光子的累積。

傳統 FLIM 通常使用脈沖激光激發樣品，再記錄熒光光子相對于激發脈沖的到達時間。由于單個光子的發射時間具有隨機性，研究人員需要反復激發同一個像素，把大量光子的到達時間“壘”成一張直方圖，再通過數學擬合估算熒光壽命。

“直方圖需要足夠多的光子才能壘得完整，一般認為每個像素點至少需要積累 3,000 個光子；即便在對精度要求較低或算法有所優化的情況下，數百個光子也是維持壽命估計可信度的底線。”這項研究的第一作者周逸亮表示。

然而，真實的生物樣品不會那么“客氣”。為了獲得更多光子，研究人員可以延長采集時間或提高激發功率，但前者可能錯過快速變化的生命過程，后者則會增加光漂白和光毒性。進入深層組織后，激發光和返回的熒光還會被組織吸收衰減，問題更加嚴重。

因此，在光子很少的情況下，怎樣估算熒光壽命是這個領域需要解決的重要問題，也是這項工作關注的核心。

周逸亮此前學習光學，是實驗室里第一個系統開展熒光壽命研究的人。從系統搭建、參數調試到算法仿真，他幾乎從頭學起。最初，團隊和許多同行一樣，把主要精力放在如何從稀疏、不完整的光子直方圖中得到更好的壽命估計。“我們圍繞這件事轉了很久。后來突然想到，大家都在壘直方圖，但為什么我們一定要壘直方圖？”他回憶道。

在周逸亮看來，這個轉折也是整項研究中最有意思的部分：“我們突然意識到，不一定非要重復別人上來第一步就做的事情，或許可以嘗試一些更有意思、更勇敢，甚至更加瘋狂的操作。”

于是，團隊決定回到更原始的數據層面。EFLIM 不再先把多次激發結果合并，而是把每次激光激發視為一個獨立事件：這次有沒有探測到光子；如果有，第一個光子何時到達。

這一思路受到 2014 年發表于 Science的“首光子成像”（First-photon imaging）研究啟發。該方法利用每個像素最先探測到的光子及其到達時間，在極低光照下恢復宏觀場景的反射率和三維結構。“這項工作用首光子到達時間估計場景信息，我們就想到，在熒光壽命顯微成像中，能不能也充分利用這個時間來估算熒光壽命？”周逸亮說。

（來源：Nature Biotechnology）

他解釋道，之所以關注首光子，并不是因為第一個光子天然包含更多信息，而是受到探測器工作方式的影響。在一次激發周期內，許多單光子探測系統通常記錄最先到達的光子；在極低光照下，每次激發也往往只有一個光子，甚至沒有光子。與其把這些記錄合并成高度稀疏的直方圖，不如圍繞每次激發和首光子重新設計壽命估計方法。

光子這么少，AI 怎樣估算壽命？

但只有零散的首光子事件，還不足以讓每個像素獨立算出壽命。EFLIM 的另一個關鍵，是將原本的壽命參數估計，轉化為時空自監督去噪問題。

熒光分子每次被激發后，在激發態停留的時間具有隨機性，但大量事件在統計上遵循一定規律，熒光壽命可以理解為這一隨機分布的平均值。EFLIM 利用這一特點，綜合相鄰位置和前后幀中的稀疏光子信息，估計平均首光子到達時間，再將其轉換為表觀平均壽命。

團隊最初也考慮過傳統的有監督學習，即讓模型把高光子壽命圖像作為標準答案。但熒光壽命對分子構象和局部微環境非常敏感，不同樣本之間即使只有細微差別，壽命分布也可能發生變化。要讓一個模型適用于多種生物場景，就需要采集大量覆蓋不同樣本的高光子訓練數據，成本高、難度也很大。

因此，團隊轉向自監督學習。模型不需要把高光子壽命圖像作為訓練標簽，而是利用稀疏數據自身構造學習信號。首光子事件表示解決了怎樣利用每次激發的問題，自監督學習則解決了沒有大量標準答案，模型怎樣訓練的問題，兩者共同構成了 EFLIM 的技術架構。

不過，借助相鄰位置和前后幀進行估計，也帶來一個疑問：AI 會不會只是在“猜”出一張看起來清楚的圖？

“光子越多，信息越多，估計結果就越接近真實值。當光子實在太少時，壽命估計一定會出現更大的偏差。”周逸亮說，“重要的不是聲稱完全消除偏差，而是盡可能定量地把偏差標定出來。”

為此，團隊首先通過仿真改變光子數量、壽命分布和樣本運動速度，觀察誤差如何變化，判斷方法在什么條件下可信、在什么條件下可能失效。隨后，他們又使用真實樣本進行驗證：先以大量光子獲得參考結果，再逐步降低光子預算，與 EFLIM 的估計結果比較。

用于基礎驗證的是一塊固定松莖橫切片，這塊樣品已經在實驗室放了四五年，周逸亮把它從角落里翻出來。由于其中恰好具有豐富的微觀結構和不同壽命分布，它最終成了檢驗 EFLIM 準確性和適用邊界的合適樣本。

團隊先對每個像素進行 20 萬次激發，獲得高光子參考數據，再從中抽取少量激發事件，模擬不同光子預算。在每個像素每幀僅進行 10 次激發、平均獲得約 0.025-0.15 個光子的條件下，EFLIM 仍恢復出穩定的熒光壽命結構，壽命信噪比約為 17dB。優于其他方法在每像素進行 1 萬次激發、平均獲得 25-150 個光子時的結果，實現了兩個數量級以上的有效光子效率提升。

（來源：Nature Biotechnology）

從活細胞到腫瘤組織，EFLIM 能用在哪里？

團隊進一步將 EFLIM 應用于清醒小鼠腦內成像、活細胞鈣信號成像、淋巴結免疫反應成像和人腦膠質瘤組織快速無標記成像。

在清醒小鼠腦內成像實驗中，動物運動、血流變化及鈣活動都會引起熒光強度波動，容易干擾傳統方法的判斷。團隊在約 250 微米深的腦組織中記錄神經元活動，EFLIM 能夠減少運動偽影和強度變化對壽命估計的影響，在低光子條件下獲得更穩定、可重復的壽命讀數，展現出其用于清醒動物腦內神經活動觀測的潛力。

團隊用 EFLIM 觀察 HeLa 細胞內的鈣信號時，在高速成像（每秒 30 幀）、每個像素平均只有 0.2-0.5 個光子的條件下，清晰捕捉到了鈣信號的動態變化，準確計算出鈣離子濃度的定量波動，解決了傳統 FLIM 成像慢、信號弱的問題。

在淋巴結免疫反應成像中，團隊用 EFLIM 在單一光譜通道中，根據不同免疫細胞的熒光壽命差異，清晰區分了 B 細胞和 T 細胞，還觀察到 T 細胞釋放的囊泡樣結構，以及這些囊泡可能介導的細胞間通信，為免疫反應研究提供了新視角。

（來源：Nature Biotechnology）

傳統病理檢測需要對組織進行染色，過程繁瑣且耗時。EFLIM 可以利用生物組織內源性分子的自發熒光壽命，實現無標記成像，快速區分膠質瘤組織中的腫瘤細胞、正常細胞、血管、壞死區域等。而且成像速度快、覆蓋范圍廣，能拼接成厘米尺度的組織圖像，有望用于腫瘤邊界識別、術中實時評估，為臨床治療提供參考。

（來源：Nature Biotechnology）

但 EFLIM 的潛在應用并不限于這幾個場景。周逸亮認為，只要光子受限，這項方法就可能發揮作用。例如在深層組織、視網膜和其他低光度成像場景中，樣本無法承受過強照射等。

EFLIM 還可能拓展熒光壽命探針的應用空間。目前，可用于定量壽命讀出的高性能探針仍相對有限。通過降低壽命估計對光子數量的需求，EFLIM 有望提升信號較弱或表達水平較低的壽命探針在高速、低光照和深層組織成像中的可用性，拓展現有壽命探針的適用范圍。

更長遠的價值在于推動定量生物學。熒光壽命能夠減少探針濃度、激發功率和部分強度偽影帶來的干擾，使研究人員更定量地觀察生物指標如何變化，并尋找免疫反應和神經活動中的新線索。

不過，周逸亮也坦言，EFLIM 仍有較大的優化空間。硬件方面，目前系統使用的光電倍增管對光子的探測效率有限。如果未來與量子效率更高的單光子探測器結合，有望進一步擴大其在極低光子條件下的適用范圍。

另一個值得探索的方向是高通量多組分成像。熒光壽命可以作為區分不同分子或細胞組分的獨立維度；將其與熒光強度、光譜和偏振等信息結合，有望在有限的探測通道內實現更高水平的多重成像，從而更全面地揭示復雜生物系統的分子組成、空間關系和動態變化。

1. Zhou, Y., Xiao, Y., Zhou, J. et al. High-fidelity fast fluorescence lifetime imaging by event-based denoising. Nat Biotechnol (2026). https://doi.org/10.1038/s41587-026-03222-0

2. Kirmani A, Venkatraman D, Shin D, Cola?o A, Wong FN, Shapiro JH, Goyal VK. First-photon imaging. Science. 2014 Jan 3;343(6166):58-61. doi: 10.1126/science.1246775.

排版：胡莉花

注:封面/首圖由 AI 輔助生成