中藥入血成分鑒定如何做，有哪些問題需要注意？

情景重現(xiàn)

經(jīng)常有小伙伴問我們，中藥入血成分鑒定相關(guān)的問題。本期我們再給大家匯報(bào)下，中藥的含藥血清制備以及后續(xù)做入血成分鑒定相關(guān)的問題和注意事項(xiàng)：

1.

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

采用正常動(dòng)物或模型動(dòng)物的血清均有，并且采用健康正常動(dòng)物應(yīng)盡量與模型動(dòng)物一致。因此，選擇健康動(dòng)物還是模型動(dòng)物需要進(jìn)一步探討。

1.2給藥方案的選擇

（1）給藥劑量：若將含藥血清看作一種藥物，那么給藥劑量取決于2 個(gè)方面：一是動(dòng)物給藥量，二是培養(yǎng)體系或反應(yīng)體系中含藥血清濃度。動(dòng)物給藥量換算公式為給藥劑量＝人臨床用量×動(dòng)物等效劑量比值×培養(yǎng)液中血清稀釋度，如果是做入血成分分析，可以適當(dāng)提高給藥劑量（5-10倍臨床劑量換算）。

（2）給藥、采血時(shí)間：目前有幾種經(jīng)驗(yàn)給藥方案：1）7～10 d 給藥法（每天 1 次，連續(xù)給藥 7～10 d）；2）3 次給藥法（連續(xù) 3 次，第 1、2 次間隔 20 h，第 2、3 次間隔 4 h）；3）2 次給藥法（第 1 次給藥后 2 h，再以相同劑量重復(fù)給藥 1 次）等。采血時(shí)間一般在末次給藥后 0.5～2 h，一般不超過 6 h，采血時(shí)間過早，部分藥物組分未被吸收入血；采血時(shí)間過長，部分藥物組分在體內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)化或被排泄掉，理想的采血時(shí)間應(yīng)落在藥物達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度期間。

1.3血清的處理

大部分研究人員對含藥血清采用 56 ℃水浴加熱 30 min的滅活方式，可以除去血清本身含有的補(bǔ)體等干擾實(shí)驗(yàn)的活性成分；也有研究人員將含藥血清經(jīng)乙醇、丙酮等有機(jī)試劑處理，通過使蛋白質(zhì)變性去除血清中的酶、激素等，從而保留藥物本身的作用。

具體可推文：《
2.中藥含藥血清制備及成分鑒定流程：

制備流程見下圖：

2.1液相條件

采用配備ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm（內(nèi)徑）× 100 mm（長度）, 1.8 μm（粒徑））（Waters Corp., MA, USA）反相色譜柱的Vanquish Flex UHPLC（Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA）超高效液相色譜進(jìn)行色譜分離。流動(dòng)相由A相（水+0.1%甲酸）和B相（乙腈）組成，洗脫梯度參見表3，流速為0.3 mL/min。色譜柱溫度為40°C。進(jìn)樣量為6.0 μL。

2.2質(zhì)譜條件

采用配備熱電噴霧離子源的四極桿軌道離子阱質(zhì)譜儀（Q Exactive?, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA）進(jìn)行質(zhì)譜分析。正、負(fù)離子的離子源電壓分別為3.7 kV和3.5 kV；毛細(xì)管加熱溫度為320°C；鞘氣壓力為30 psi，輔助氣壓力為10 psi；溶劑加熱蒸發(fā)溫度為300°C；鞘氣和輔助氣均為氮?dú)猓慌鲎矚鉃榈獨(dú)猓瑝毫?.5 mTorr。采用Full scan/dd-MS2模式采集數(shù)據(jù)，F(xiàn)ull scan參數(shù)：分辨率70000，自動(dòng)增益控制目標(biāo)1×106，最大隔離時(shí)間50 ms，質(zhì)荷比掃描范圍100 – 1500；dd-MS2參數(shù)：分辨率17500，自動(dòng)增益控制目標(biāo)1×105，最大隔離時(shí)間50 ms，質(zhì)量分離窗口2，碰撞能10 V、30 V、60 V，強(qiáng)度限定1×105。

2.3數(shù)據(jù)分析

采用Progenesis QI 3.0軟件（Waters Corp., MA, USA）處理采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，步驟依次為導(dǎo)入原始數(shù)據(jù)、峰提取、去卷積。搜索對照品數(shù)據(jù)庫（TCM Pro 2.0）和理論數(shù)據(jù)庫（通過文獻(xiàn)、公共數(shù)據(jù)庫等構(gòu)建），通過對照品保留時(shí)間誤差、母離子質(zhì)量誤差、二級碎片匹配、同位素分布、峰強(qiáng)度等對鑒定結(jié)果進(jìn)行多維綜合判斷分析，得到最終結(jié)果。

2.4 結(jié)果案例

基峰圖：

3.相關(guān)問題探討

3.1 樣本制備用什么品系的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

R：一般選擇SD大鼠。大鼠血清量大，灌胃溫順。也有選擇后續(xù)藥效評價(jià)造模動(dòng)物的品系一致的。若選擇健康動(dòng)物灌胃，排除造模對中藥吸收的干擾；若用造模動(dòng)物灌胃制備血清，可以排除因批次不同，對動(dòng)物吸收的影響。

3.2 動(dòng)物灌胃劑量

R：一般中藥都有臨床劑量，選擇正常動(dòng)物可以5-10倍劑量灌胃，如果用模型動(dòng)物，一般用高劑量來檢測入血成分。

3.3 血清細(xì)胞藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)用含藥血清還是凍干粉

R：一般選擇含藥血清開展后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；也有部分地區(qū)的專家建議用凍干粉。目前沒有統(tǒng)一，大部分老師會(huì)采用含藥血清。

3.4 為什么要做入血成分鑒定

R：考察中藥復(fù)方有哪些成分吸收進(jìn)入血液循環(huán)。進(jìn)一步可以考察入靶器官。不入血入靶器官的也有很多情況可能，比如小檗堿不入血，但入腸道。

3.5 入血成分原型沒有檢測到，那中藥是如何發(fā)揮作用的

R：也有可能通過腸道菌群發(fā)揮作用。再結(jié)合腦腸軸、肺腸軸等發(fā)揮作用。

3.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)用入血原型做還是原型+代謝物一起分析

R：將入血原型成分與代謝物共同納入網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析是當(dāng)前的主流和更優(yōu)選擇。這能最大限度地降低假陰性風(fēng)險(xiǎn)，確保你不會(huì)錯(cuò)過任何真正在體內(nèi)發(fā)揮作用的活性分子。

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