復方2區-if6.8！江西中醫藥大學團隊揭示滋腎清熱利濕化瘀方通過C/EBPβ/STAT3信號傳導恢復顆粒細胞穩態改善多囊卵巢綜合征

【寫在前面】：本期推薦的是由江西中醫藥大學、江西中醫藥大學附屬醫、江西中醫藥大學婦產科研究所等研究團隊合作近期發表于Journal of Ethnopharmacology(IF6.8）的一篇文章，揭示滋腎清熱利濕化瘀方通過C/EBPβ/STAT3信號傳導恢復顆粒細胞穩態改善多囊卵巢綜合征。

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

Zishen Qingre Lishi Huayu recipe improves polycystic ovary syndrome by restoring granulosa cell homeostasis via C/EBPβ/STAT3 signaling

摘要

多囊卵巢綜合征（PCOS）是一種以排卵障礙為特征的多因素內分泌紊亂。滋腎清熱利濕化瘀方ZQLHR是一種中藥方劑，通過有效提高PCOS患者的排卵率和月經周期規律性，顯示出臨床療效，并在實踐中得到廣泛應用；然而，其潛在的藥理機制尚未完全闡明。

研究目的

本研究旨在闡明ZQLHR如何通過C/EBPβ/STAT3信號軸調節PCOS患者卵巢顆粒細胞（GC）的增殖-凋亡平衡。

方法

分析PCOS和非PCOS患者的人顆粒細胞（hGCs）的增殖、凋亡和C/EBPβ/STAT3表達。在體內，對來曲唑誘導的PCOS小鼠進行scAAV介導的C/EBPβ敲除，然后給予ZQLHR以評估治療結果。在體外，C/EBPβ或STAT3在人顆粒樣腫瘤細胞系（KGN）細胞中沉默，以探索它們在增殖和凋亡中的調節關系和作用。此外，以劑量和時間依賴的方式評估了ZQLHR的影響。值得注意的是，CETSA首次被用于確認ZQLHR與C/EBPβ的直接結合，隨后用ZQLHR處理C/EBPα沉默的細胞，以檢查其作用是否涉及C/EBPγ依賴的STAT3。通過組織學和分子生物學實驗進一步評估了ZQLHR的藥理機制。

結果

PCOS患者來源的GC表現出增殖減少、凋亡增加和C/EBPβ/STAT3表達降低。在LET誘導的PCOS小鼠中，ZQLHR治療顯著改善了動情周期規律、激素平衡、卵泡發育和GC凋亡，同時調節了C/EBPβ/STAT3通路。C/EBPβ敲除加劇了卵巢功能障礙和KGN凋亡，而ZQLHR減弱了這些作用并部分恢復了通路活性。在體外，C/EBPβ和STAT3相互影響，CFTR表達與增殖和凋亡的變化有關。ZQLHR以劑量和時間依賴的方式增加增殖標志物（PCNA、細胞周期蛋白D1）并減少凋亡標志物（Caspase-3、PARP），CETSA證實其與C/EBPβ直接結合。值得注意的是，盡管C/EBPβ被敲除，ZQLHR仍部分恢復了KGN細胞的增殖，并適度調節了C/EBP？/STAT3信號通路。

結論

ZQLHR通過調節C/EBPβ/STAT3通路改善多囊卵巢綜合征的GC穩態并促進卵泡發育。

圖文摘要

【前言】

多囊卵巢綜合征（PCOS）是育齡婦女中一種常見的內分泌疾病，其特征是慢性無排卵、高雄激素血癥和多囊卵巢形態。由于當代生活方式和環境暴露的改變，多囊卵巢綜合征的發病率一直在上升。根據最近的流行病學數據，2021年有230萬新的多囊卵巢綜合征病例，比1990年增加了26.77%。到2021年，全球流行的多囊卵巢綜合征病例數已超過6000萬。多囊卵巢綜合征患者不僅生育能力下降，生活質量下降，還承受著相當大的社會和心理壓力，造成了巨大的全球經濟負擔。在其多種臨床表現中，卵泡障礙仍然是不孕的主要原因，改善排卵是臨床管理的一大挑戰。目前PCOS誘導排卵的治療主要集中在促進卵泡發育和誘導排卵上，克羅米芬和促性腺激素等藥物干預被廣泛使用。盡管這些方法大大擴大了治療的可能性，但某些局限性仍然存在。這些方法往往受到次優療效、不良反應和卵泡發育缺乏持續改善的限制，這對實現有效的生育結果構成了重大挑戰。因此，迫切需要制定一種安全有效的替代新策略。

鑒于GC在卵泡發育中的關鍵作用以及在PCOS中觀察到的其增殖受損和凋亡增加，CCAAT/增強子結合蛋白β（C/EBPβ）和信號轉導子和轉錄激活子3（STAT3）介導的信號通路已成為這一背景下的潛在調節機制。C/EBPβ是C/EBP家族的成員，在包括卵巢在內的各種組織中表達，并調節基因轉錄以響應細胞因子、激素和炎癥信號。在PCOS患者的GC中，C/EBPβ下調，這可能導致GC中觀察到的增殖受損和凋亡增加。此外，STAT3是一種由一系列細胞因子和生長因子激活的多功能轉錄因子，因其在控制細胞生長、存活和免疫反應中的作用而得到廣泛認可。值得注意的是，在PCOS患者中，STAT3的表達水平低于對照組，這可能會損害子宮內膜的容受性，從而影響妊娠結局。這些發現共同強調了C/EBPβ/STAT3軸是PCOS發病機制的潛在介質，也是治療調節的有前景的靶點。

中醫藥通過多種機制和靶點在多囊卵巢綜合征的治療中顯示出顯著的療效。中藥滋腎清熱利濕化瘀方ZQLHR由山茱萸、知母、黃柏、玄參、白介子、薏苡仁、桃仁、丹參、甘草組成，在臨床上顯著改善了多囊卵巢綜合征。我們之前的研究表明，ZQLHR有效地提高了PCOS患者的排卵率和月經周期規律性，同時改善了痤瘡癥狀并降低了血清睪酮（T）水平。綜合iTRAQ蛋白質組學、轉錄組學和網絡藥理學分析表明，ZQLHR干預可能會影響多種生物過程，包括炎癥、孕酮介導的卵母細胞成熟、凋亡和增殖。在已鑒定的差異表達基因中，C/EBPβ和STAT3成為關鍵的調控因子。

在本研究中，我們通過研究C/EBPβ/STAT3信號通路在PCOS病理生理學中的作用，并闡明中藥ZQLHR的治療機制，試圖填補這些重要空白。結合臨床數據分析、PCOS動物模型體內實驗和體外細胞實驗，我們研究了C/EBPβ/STAT3信號通路在PCOS中的作用以及ZQLHR在調節該通路中的藥理作用。此外，我們確定C/EBPβ是PCOS中GC增殖損傷的核心介質，也是ZQLHR治療效果的關鍵靶點，可能是通過促進C/EBPα的穩定性。通過將傳統草藥與當代機械論的見解聯系起來，本研究為研究結果的臨床翻譯提供了基礎。

【結果部分】

1.PCOS 患者（n=33-35）GCs細胞中存在增殖與凋亡失衡以及C/ EBPβ /STAT3信號通路抑制現象。

2.ZQLHR 的總離子色譜圖（n=3）。

3.ZQLHR 對LET誘導的 PCOS 的影響（n=10）。

4.ZQLHR 對LET誘導的 PCOS 的影響（n=10）。

5.ZQLHR 通過C/ EBPβ /STAT3通路對LET誘導的 PCOS（n=10）中GC細胞凋亡的影響。

6.ZQLHR 對 KGN 細胞增殖、細胞凋亡及C/EBPβ/STAT3信號通路調控的時程與劑量依賴性效應（n=3）。

7.ZQLHR 對 KGN 細胞（n=3）中C/ EBPβ /STAT3通路活性的時間及劑量依賴性影響。

8.siRNA-C/EBPβ對STAT3和CFTR表達以及KGN細胞增殖與凋亡的影響（n=3）。

9.siRNA-STAT3對C/EBPβ和CFTR表達以及KGN 細胞增殖與凋亡的影響（n=3）。

10.C/EBPβ過表達及STAT3挽救對 CFTR 蛋白表達、KGN細胞增殖及凋亡的影響（n=3）。

11.ZQLH在si-C/ EBPβ 干擾條件下對 KGN 細胞增殖、凋亡及C/EBPβ/STAT3信號通路的影響（n=3）。

12.ZQLHR 治療 PCOS 的調控機制。

【結論與討論】

總之，本研究表明，ZQLHR有效地調節卵巢顆粒細胞的增殖-凋亡平衡，從而改善PCOS樣表型，可能是通過調節C/EBPβ/STAT3信號通路。C/EBPβ的下調加劇了PCOS患者的卵巢功能障礙，突顯了其在疾病進展中的關鍵作用。我們的研究結果還初步揭示了顆粒細胞中C/EBPβ和STAT3之間的相互調節關系。

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